Dictaat Moleculaire Genetica 2
Door Erik Meijer
Inleiding
In dit vak ligt de focus niet persé op de processen aangaande DNA en RNA, maar vooral op hoe deze
processen worden gereguleerd. Het eerste onderwerp wat behandeld wordt in dit vak is de globale
structuur van chromosomen. Hierbij wordt onder andere gekeken naar modificaties aan histonen die
bepaalde mate van compactie veroorzaken. Dit is al in mindere mate aan bod gekomen bij MG1. Bij
het tweede onderwerp wordt er gekeken naar het DNA zelf. Hierbij moet je denken aan zaken als
transpositie en site-specifieke recombinatie, en hoe deze processen zorgen voor regulatie. Als derde
wordt er gekeken naar de verwerking van RNA. Hierbij moet er gedacht worden aan zaken als
splicing, transport, etc. Er wordt hierbij ook gekeken naar de tijd toen RNA nog de enige vorm van
genetische informatie was. Het vierde onderwerp is de regulatie van translatie. Hierbij wordt
gekeken naar de vertaling van RNA naar eiwit en hoe dit proces wordt gereguleerd. Het vijfde
onderwerp is de controle van genexpressie en het laatste onderwerp is posttranscriptionele
controle. Dit proces wordt gereguleerd door non-coding RNA. Deze RNAs kunnen mRNA afbreken of
het stopzetten van de expressie van het mRNA.
Globale structuur van chromosomen
Hoofdstuk 4: p 194-216 (Alberts)
Elk organisme heeft een specifiek aantal chromosomen. Soorten met een groter genoom zijn
geëvolueerd door duplicatie van het gehele genoom van de voorouder. Alle verschillende cellen in
het lichaam worden gestuurd door hetzelfde DNA, echter door middel van controleprocessen heeft
de ene cel een heel andere functie dan de andere. Er is veel kennis over chromosomaal DNA
verkregen door het bestuderen van gistcellen. Gist heeft veel toepassingen als het gaat om
fundamenteel onderzoek, omdat gist één van de makkelijkst te bestuderen eencellige eukaryote cel
is. De kennis van chromosomaal DNA geeft ons toegang tot veel nieuwe ontwikkelingen. Dit kan
uiteenlopen van het kweken van specifieke plantsoorten, tot het ontwikkelen van biobrandstoffen,
tot het genezen van bepaalde genetische ziekten. Dit kan niet alleen door mutaties in het DNA aan
te brengen, maar ook door de controle aan te passen. Zo kan er bijvoorbeeld gezorgd worden dat de
groei van een bepaalde plant wordt gestimuleerd door bepaalde genen in of uit te schakelen.
DNA bevindt zich in een dubbele helix. Die dubbele helix bestaat uit
twee DNA strengen die complementair aan elkaar staan. Er zit in de
helix een minor en een major groove. Een winding van de helix is 3.5
nm lang of 10 baseparen (zie afbeelding hiernaast). Het menselijk
genoom is 6.4 miljard baseparen en vormt dus een afstand van
ongeveer 2 meter lang als het helemaal recht zou zijn. Dit is ongeveer 200,000 keer te lang voor de
cel. Als al het DNA van elke cel in een menselijk lichaam recht aan elkaar
geplakt zou worden, zou de afstand 1,000 keer de afstand tussen de aarde en
de zon zijn. Om dit dichter op elkaar te krijgen, wordt er gebruik gemaakt van
histoneiwitten. Deze eiwitten vormen histonen die bestaan uit acht subunits.
Er zijn vijf verschillende soorten histoneiwitten, namelijk H1, H2A, H2B, H3 en
H4. Behalve van H1, zitten er twee van elk soort in een histon. H1 heeft een
andere functie. De N-termina van de acht eiwitten steken buiten het histon
(zie afbeelding). Deze flexibele uiteinden kunnen gemodificeerd worden. Deze
modificaties zijn verantwoordelijk voor het reguleren van DNA-expressie.
, DNA wordt om histonen heen gevouwen tot chromatine. Allereerst
bindt een tetrameer (vier subunits) van twee H3 en twee H4 eiwitten aan
het DNA. Deze binding zorgt voor de eerste vouwing van het DNA om de
histon heen. Vervolgens bindt een dimeer van H2A en een dimeer van
H2B aan het histon in vorming. Het DNA vouwt door die binding verder
om het histon heen en het geheel wordt gestabiliseerd (zie afbeelding
links). Tussen de met DNA gewikkelde histonen zit zogenaamd linker
DNA. Een histon met DNA en een stuk linker DNA wordt ook wel een
nucleosoom genoemd. Het DNA met
histonen wordt ook wel ‘beads on a string’
genoemd. Over het algemeen zitten AA, TA
en TT dinucleotiden in de minor groove die
tegen het histon aanzit, dus aan de
binnenkant. G-C baseparing zit vooral in de
minor groove aan de buitenkant. Zie
afbeelding rechts. De histonen zitten op dit
punt nog relatief ver uitelkaar. Om de
histonen dichterbij elkaar te brengen, bindt
H1 aan het linkerDNA en zorgt dat
deze onder een hoek komt te liggen
ten opzichte van het histon. Dit zorgt niet alleen voor extra
compactie, maar ook voor stabilisatie. De nucleosomen coilen
op elkaar waardoor er een zogenaamde chromatine fiber
ontstaat. Hiernaast staan alle verdere compactiefasen tot
uiteindelijk een chromosoom te zien is. Zie afbeelding links.
Alle essentiële processen zoals transcriptie, replicatie,
recombinatie en DNA-reparatie nemen plaats bij DNA met
histonen. Er is een samenhang tussen de structuur van de
chromatine en deze processen. Er kan zo bijvoorbeeld alleen
genexpressie plaatsvinden op het linker DNA en niet bij het DNA
om de histon heen. Er kan dus veel gereguleerd worden aan de
hand van de positie van het DNA om de histonen heen.
Veel van het begrip van chromatine fiber komt van de
studie van abnormale chromosomen. Eén van deze
abnormale chromosomen werd al in 1882 waargenomen.
Dit was het zogenaamde lampbrush chromosoom. Deze
chromosomen zien eruit als de borstels die toentertijd
gebruikt werden om lampen schoon
te maken. Zie afbeelding rechts. In
deze chromosomen vindt er
constant RNA-synthese plaats.
Wanneer RNA-synthese plaats moet vinden, wordt er namelijk een soort van
loop (=lus) gevormd uit het compacte DNA, zodat deze beschikbaar komt voor
transcriptie. Zie afbeelding links. Wanneer er veel RNA-transcriptie op een
chromosoom plaatsvindt, ontstaan er dus erg veel loops. Daardoor ontstaat er
een beeld dat lijkt op een lampenborstel.
,Later is een methode ontwikkelt om de exacte positie te
bepalen van loops in chromosomen die in de interfase
(rustfase) zitten. Deze methode heet 3C (Chromosome
Conformation Capture). Allereerst worden er DNA probes
(=sonde) geplaatst op het DNA. Vervolgens wordt het DNA
behandelt met formaldehyde. Op de plaats waar de loop
gevormd wordt zit een DNA-bindingseiwit en hier wordt een
crosslink gevormd. Vervolgens wordt het DNA in de loop voor
een gedeelte weggeknipt met een restrictienuclease. Hierna
wordt het DNA weer aan elkaar geplakt en worden de cross-
links verwijdert. Aan de hand van de probes kan dan getest
worden welk stuk van het DNA geknipt is en waar dus een loop
zat. Het is wel belangrijk dat het DNA verdund wordt, zodat de
juiste gedeelten van het DNA weer aan elkaar geplakt worden.
Zie afbeelding rechts. Over het algemeen is een loop 50,000 tot
200,000 nucleotideparen groot. Dit kan echter oplopen tot een
miljoen.
Een andere abnormaal chromosoomtype zijn polytene chromosomen.
Dit type bevindt zich onder andere in zeer grote cellen in de
speekselklieren van de bananenvlieg. In deze cellen zitten meerdere
chromosoomkopieën van dezelfde vier chromosomen aan elkaar
geplakt. Zie afbeelding links. De donkere banden zijn de dicht verpakte
gedeeltes van het chromosoom. Hierin bevindt zich 95% van het DNA en
één band bestaan uit ongeveer 200,000 baseparen. De overige 5%
bevindt zich in de witte banden (ook wel interbanden genoemd) die
ongeveer 3,000 baseparen lang zijn.
Zie afbeelding rechts. Er zijn ook
zogenaamde ‘puffs’ (blaasjes) waar te
nemen. Deze ontstaan wanneer
interbanden tot expressie komen. Dit
is aangetoond door een 3H-UTP te
plakken aan gesynthetiseerd RNA en
zo is er waargenomen dat er
inderdaad RNA transcriptie plaatsvindt bij deze ‘puffs’.
In de mens zijn er maar liefst 46 chromosomen. Het zou niet goed zijn als al deze chromosomen door
elkaar zouden drijven, want ze zouden verstrengeld kunnen raken. Dit
beïnvloedt de mate van expressie, en er kunnen verkeerde strengen aan
elkaar worden geplakt bij schade. In werkelijkheid bevindt elk chromosoom
zich in een specifieke regio in de celkern, zodat ze niet verstrengeld kunnen
raken. De posities zijn wel beweeglijk, alleen beweegt alles in dezelfde
richting. Dit is waargenomen door middel van FISH (fluorescence in situ
hybridisation). Hierbij worden fluorescente markers toegevoegd die
allemaal aan een specifieke chromosoom binden en een eigen kleur
hebben. Hierdoor krijgen alle chromosomen een eigen kleur en kan hun
locatie worden waargenomen. Zo werd ontdekt dat elk chromosoom een
eigen plaats heeft binnen de celkern. Zie afbeelding links. Een chromosoom
heeft een specifieke ligging binnen zijn territorium. De vouwing is zo
, specifiek dat gebieden die bij elkaar liggen op het chromosoom ook bij elkaar gevouwen worden.
Deze vouwing is dusdanig dat het chromosoom compact wordt, maar wel gemakkelijk kan
ontvouwen voor genexpressie. De vouwing is in een zogenaamde globule conformation (=
bolconformatie). Zie onderstaande afbeelding.
Wanneer wordt gekeken naar waar de gen rijke gebieden liggen, dan is te zien dat er maar weinig
coderende genen naast het membraan zijn. Dit is aangetoond door fluorescente probes te binden
aan de zogenaamde Alu-repeat. Deze sequentie
komt vaak voor in coderende genen. Chromatine kan
verplaatsen naar specifieke plaatsen in de nucleus
om genexpressie te veranderen. Het komt los van
het dicht verpakte chromosoom in een lange loop en
kan zelfs buiten het territorium van het chromosoom
reizen. Vaak is het zo dat genen die actief zijn buiten
het territorium treden. Het kan echter ook zo zijn dat
een gen wat niet tot expressie mag komen, buiten
het territorium wordt gebracht naar een gebied met
veel heterochromatine, zodat het niet tot expressie
kan komen. Zie afbeelding rechts.
De celkern heeft verschillende compartimenten. Deze
compartimenten bevatten een hoge concentratie van specifieke
eiwitten (waaronder transcriptiefactoren) en RNA die nodig zijn voor
een efficiënte transcriptiesnelheid. Een voorbeeld hiervan is de
nucleolus. De functie van de nucleolus is om ribosomen te
produceren. Er zijn miljoenen ribosomen nodig om alle translatie te
faciliteren. Genen die transcriberen voor ribosomen vormen loops
naar de nucleolus toe waar de transcriptie van deze genen kan
plaatsvinden. Zie afbeelding links.
