Hoorcollege 14
https://xerte.uu.nl/play.php?template_id=1343#page1 (HIV-eiwitten oefenen)
Diagnose van HIV
• ELISA
• Western blot
Monitoring
• CD4-telling ® FACS (fluorescense activated cell sorting)
• Viral load ® RT-PCR
De mate van HIV wordt ondergedeeld in de Fiebig stages van I-VI, afhankelijk van hoe ernstig het is.
ELISA ® enzyme-linked immunosorbent assay
• Gebruikt als HIV-test
• Een plastic wellplaat is gecoat met HIV of HIV-eiwitten
• Hierin wordt het patiënten serum gepipeteerd
• Het serum heeft verschillende antilichamen en andere eiwitten
o Als de patiënt HIV geïnfecteerd is zal hij antilichamen hebben tegen HIV of HIV-
eiwitten en deze zullen binden aan de plaat
• Dan wordt een conjugaat toegevoegd
o Antilichaam met een enzym gekoppeld, dat bindt aan het menselijke antilichaam
• Voeg vervolgens substraat voor het enzym toe
• Wanneer het conjugaat gebonden is aan het menselijke antilichaam geeft het kleur af of
wordt het fluorescent
Western blot
• Gebruikt als HIV-test
• Je runt een gel met eiwitten van HIV en deze
breng je over op een drager zodat de eiwitten vast
komen te zitten (block)
• Dan incubeer je het membraan met serum van de
patiënt en was je
• Dan incubeer je met een HRP-gelabeld tweede
antilichaam dat bindt aan het patiënt antilichaam
en was je opnieuw
• Incubeer de blot dan met chemiluminescent HRP-
substraat om bandjes te kunnen zien
• Western blot is specifieker maar duurt langer
o Wordt gebruikt als ondersteuning als er
twijfel is over positiviteit bij ELISA
, FACS ® fluorescence activated cell sorting
• Gebruikt voor CD4 telling
• Je hebt een sample met cellen die je met flow cytometry onderzoekt
o Je hebt het sample al behandeld met een
fluorescent antilichaam dat bindt aan CD4
• Het sample wordt verneveld en aangestraald met licht
o Wanneer het gebonden fluorescente antilichaam
aangestraald wordt geeft het een fluorescent
signaal af dat waarneembaar is op de computer
o Dit kan met verschillende kleuren
o Kan kwantitatief of kwalitatief
RT-PCR ® reverse transcriptase polymerase chain reaction
• HIV RNA zit in het bloed
o Kan makkelijk geïsoleerd worden door fenol
extractie
• Wordt gebruikt als een surrogaat marker om de viral load te bepalen
o Goede maat voor inschatting van de ernst van HIV
HIV-therapie verbeteren
• Geen vaccin? ® dan maar een therapie ontwikkelen
• Tot 1993 had je alleen maar AZT (azidothymidine) en behandeling voor opportunistische
infecties
o Voor AZT werden patiënten na 1,5 jaar resistent door mutaties in RT
• In 1993 werden drie klasse medicijnen ontwikkeld/ontdekt
• Ideale HIV-medicijnen
o Medicijnen die binding aan CD4 T-cellen blokkeert
o RT-inhibitors
o Integratie inhibitors
o Medicijnen die HIV proteases remmen
• Doel van de medicijnen ® latente periode verlengen, dus de replicatie verminderen
• NRTIs ® nucleotide reverse transcriptase inhibitors
o AZT ® azidothymidine
• nNRTIs ® non-nucleotide reverse transcriptase inhibitors
o Ontwikkeld rond 1993
https://player.vimeo.com/video/260291607 ® handig filmpje, samenvatting HIV-infectie en
replicatie
NRTI-werkingsmechanisme
• Werking van alle nucleotide analogen
• AZT of iedere nucleotide analoog wordt ingebouwd maar
doordat deze analogen een OH-groep missen aan het 3e
koolstof wordt de keten niet verder verlengd, en wordt de
synthese geblokkeerd
https://xerte.uu.nl/play.php?template_id=1343#page1 (HIV-eiwitten oefenen)
Diagnose van HIV
• ELISA
• Western blot
Monitoring
• CD4-telling ® FACS (fluorescense activated cell sorting)
• Viral load ® RT-PCR
De mate van HIV wordt ondergedeeld in de Fiebig stages van I-VI, afhankelijk van hoe ernstig het is.
ELISA ® enzyme-linked immunosorbent assay
• Gebruikt als HIV-test
• Een plastic wellplaat is gecoat met HIV of HIV-eiwitten
• Hierin wordt het patiënten serum gepipeteerd
• Het serum heeft verschillende antilichamen en andere eiwitten
o Als de patiënt HIV geïnfecteerd is zal hij antilichamen hebben tegen HIV of HIV-
eiwitten en deze zullen binden aan de plaat
• Dan wordt een conjugaat toegevoegd
o Antilichaam met een enzym gekoppeld, dat bindt aan het menselijke antilichaam
• Voeg vervolgens substraat voor het enzym toe
• Wanneer het conjugaat gebonden is aan het menselijke antilichaam geeft het kleur af of
wordt het fluorescent
Western blot
• Gebruikt als HIV-test
• Je runt een gel met eiwitten van HIV en deze
breng je over op een drager zodat de eiwitten vast
komen te zitten (block)
• Dan incubeer je het membraan met serum van de
patiënt en was je
• Dan incubeer je met een HRP-gelabeld tweede
antilichaam dat bindt aan het patiënt antilichaam
en was je opnieuw
• Incubeer de blot dan met chemiluminescent HRP-
substraat om bandjes te kunnen zien
• Western blot is specifieker maar duurt langer
o Wordt gebruikt als ondersteuning als er
twijfel is over positiviteit bij ELISA
, FACS ® fluorescence activated cell sorting
• Gebruikt voor CD4 telling
• Je hebt een sample met cellen die je met flow cytometry onderzoekt
o Je hebt het sample al behandeld met een
fluorescent antilichaam dat bindt aan CD4
• Het sample wordt verneveld en aangestraald met licht
o Wanneer het gebonden fluorescente antilichaam
aangestraald wordt geeft het een fluorescent
signaal af dat waarneembaar is op de computer
o Dit kan met verschillende kleuren
o Kan kwantitatief of kwalitatief
RT-PCR ® reverse transcriptase polymerase chain reaction
• HIV RNA zit in het bloed
o Kan makkelijk geïsoleerd worden door fenol
extractie
• Wordt gebruikt als een surrogaat marker om de viral load te bepalen
o Goede maat voor inschatting van de ernst van HIV
HIV-therapie verbeteren
• Geen vaccin? ® dan maar een therapie ontwikkelen
• Tot 1993 had je alleen maar AZT (azidothymidine) en behandeling voor opportunistische
infecties
o Voor AZT werden patiënten na 1,5 jaar resistent door mutaties in RT
• In 1993 werden drie klasse medicijnen ontwikkeld/ontdekt
• Ideale HIV-medicijnen
o Medicijnen die binding aan CD4 T-cellen blokkeert
o RT-inhibitors
o Integratie inhibitors
o Medicijnen die HIV proteases remmen
• Doel van de medicijnen ® latente periode verlengen, dus de replicatie verminderen
• NRTIs ® nucleotide reverse transcriptase inhibitors
o AZT ® azidothymidine
• nNRTIs ® non-nucleotide reverse transcriptase inhibitors
o Ontwikkeld rond 1993
https://player.vimeo.com/video/260291607 ® handig filmpje, samenvatting HIV-infectie en
replicatie
NRTI-werkingsmechanisme
• Werking van alle nucleotide analogen
• AZT of iedere nucleotide analoog wordt ingebouwd maar
doordat deze analogen een OH-groep missen aan het 3e
koolstof wordt de keten niet verder verlengd, en wordt de
synthese geblokkeerd
