Class notes
Outils et technique de biologie moléculaire
- Course
- Institution
Présentation approfondit des outils et technique de base de la biologie moléculaire, indispensable a la pratique en laboratoire
[Show more]
Seller
Follow
nassimathamnia
Content preview
Préparations des acides nucléiques1) Rappel de la structure des acides nucléiques
- Les sucres = ribose (ARN), désoxyribose (ADN)
- Les bases = Guanine, Adénine, Thymine, cytosine (ADN) , et uracile (ARN)
Sucre + base = nucléoside
Sucre + base + phosphate = nucléotide.
La polymérisation d’un acide nucléique se fait par condensation → libération de 2 phosphate et un H20. Elle se fait
toujours dans le sens 5’→3’. Cette réaction est catalysée par des enzymes de type polymérase.
Structure d’un polynucléotide
Une extrémité 5’ Phosphate et les sucres sont accroche au phosphate par liaison phosphodiester et se termine par
une extrémité 3’OH.
L’appariement entre les bases complémentaires se fait de manière que La base A fait 2 liaison hydrogène avec T ou le
U, et la base C fait 3 liaison hydrogène avec la G.
L’ADN est un modèle en une double hélice qui porte 2brins d’ADN antiparallèle organisé en hélice enroule et des
bases sont liée par des liaison H, sui sont de faible énergie pour la stabilité de l’ADN.
L’ARN est une molécule linéaire, qui a des structures secondaire en épingle à
cheveux ou boucles .il n’existe pas de double hélice d’ARN , il se replie sur lui-même
et sa fonction est définie par ce repliement . EX : ARNr .
2) Méthodes d’extraction et de séparation des acides nucléiques
Les acides nucléiques sont séparés des autres molécules présent dans les cellules en utilisant leurs spécificité
physico-chimique:
- Grande taille, poids moléculaire élevé
- Forte charge négative (phosphates)
- Hydrophylique ou hydrophobique selon le pH, la présence de sel et la concentration.
Deux étapes principales:
- Lyse pour libérer et solubiliser les acides nucléiques
La méthode de lyse doit être adaptée à l’échantillon pour faciliter la purification et préserver l’intégrité des acides
nucléiques. Inclus parfois des enzymes pour dégrader les parties dures de l’échantillons (cellulase, collagénase,
lysozyme, protéinase K…)
- Elimination chimique ou enzymatiques des contaminants
(Protéines, polymères de sucres, autres acides nucléiques, inhibiteurs…). Souvent en plusieurs étapes successives
OBM Anjard 1
, -Lyse avec neutralisation des
enzymes pour éliminer tous ce
qui n’est pas Ac nucléique.
-l’extraction par les solvants
organiques élimine les protéines
qui s’accroche à l’ADN.
-sel et éthanol rendent l’ADN
insoluble qui se descendre en bas
Préparation de plasmide, exemple de la lyse alcaline de bactéries
- Centrifuger les bactéries (E. coli)
- Eliminer le surnageant
- Re suspendre les bactéries dans 250 μl d’eau.
- Ajouter 250 μl d’une solution de 0,2 M NaOH, 1% SDS
- Neutraliser avec 250 μl d’une solution d’acétate de sodium à 3 M pH5,2
- Centrifuger pour éliminer les débris cellulaires.
✓ Le surnageant contient le plasmide qui est purifier par précipitation.
L’extraction par les solvants organiques
• L’ADN est dans la phase
aqueuse si le pH>7,5
• L’ARN est dans la phase
aqueuse si le pH<5
OBM Anjard 2
,Purification sur colonne échangeuse d’anions
- Liaison ionique grâce aux fortes charges négatives de l’ADN.
- Lavage avec une faible concentration de sel (NaCl, KCl...)
- Elution avec une forte concentration de sel
Purification sur colonne de silice (grains de sable)
- Déstabilisation des liaisons hydrogènes en présence d’agent chaotropique (guanidium, perchlorate de lithium, urée
...) qui permet une liaison ionique ou hydrophobe sur la matrice de silice. L’ADN étant chargé négativement (-), va se
lier sur la matrice qui est charge positivement (+).
- Ajout d’agent chaotropique à l’ADN
- Fixation de l’ADN sur la résine de silice
- Lavage avec une solution d’alcool
- Elution avec de l’eau ou 10 mM tris pH 8.
Ultracentrifugations
Basé sur le gradient de densité continu en chlorure de césium.
Mais il y a une utilisation d’une grande quantité de bromure
d’éthidium. (Faible densité en haut, forte densité en bas).
Apres l’ultracentrifugation, il y a prélèvement de la bande
d’intérêts suivie de purification de l’ADN(précipitation). Mais il
faut que l’ADN soit super purifié.
Précipitation des acides nucléiques
Sels → neutralise les charges (-)
Alcool → ADN =hydrophobique =insoluble va précipiter mais tout l’autre
métabolite reste en solution.
Pratiquement tous les sels fonctionnent :
- Sels les plus utilisés : NaCl > 0,2 M /LiCl > 1M/Acétate de Sodium pH 5,2 > 0,3 M
- Alcool utilisés : Ethanol: 2 x vol aqueux /Isopropanol: 0,7 x vol aqueux
Refroidir si la concentration en ADN est faible.
OBM Anjard 3
, Comparaison des méthodes de purification :
- Précipitation:
+ Rapide, rendement élevé, adaptable sur une grande plage de conditions (20ng/ml-10 mg/ml).
- Elimine seulement les molécules solubles, purification insuffisante à partir de lysats brute. Utilisée en finition après
d’autres méthodes ou pour reconcentrer l’ADN.
- Extraction au phénol/chloroforme :
+ Inactive tous les enzymes et élimine toutes les protéines. Séparation ADN/ARN selon le pH.
- Rendement moyen, nécessite d’éliminer les traces de phénol qui peux interférer avec l’utilisation de l’ADN.
Toxique.
→ Suivie d’extraction au chloroforme et/ou précipitation à l’éthanol pour éliminer les traces de phénol.
- Colonnes échangeuses d’ions ou de silice :
+ Assez rapide, bon rendement.
- Séparation partielle des différent acides nucléiques, n’élimine pas toute les protéines (calibré pour une gamme de
quantité étroite ex: midi prép =20-100 μg) .
➔ Les agents chaotropique dénature l’ADN.
➔ Précipitation pour éliminer les sels
- Gradient de chlorure de césium :
+ Acide nucléiques extrêmement pur. Sépare les ADN circulaires, linéaires et les ARN
- Rendement correct si plus de 100 μg d’ADN (ne marche pas pour moins de 20 μg), lent, nécessite du matériel
spécialisé.
→ Précipitation pour éliminer le chlorure de césium, utilisation de bromure d’éthidium.
3) Quantification et analyse des acides nucléiques
Analyse des échantillons d’acides nucléiques
- Mesure du spectre UV grâce au spectrophotomètre, qu’il
faut calibrer d’abord avec un « blanc » = sans acide nucléique.
- Il faut utiliser de l’eau pure ou tampon dilué pour limiter les
interférences et que les échantillons soient préparés dans les
mêmes conditions.
OBM Anjard 4
The benefits of buying summaries with Stuvia:
Guaranteed quality through customer reviews
Stuvia customers have reviewed more than 700,000 summaries. This how you know that you are buying the best documents.
Quick and easy check-out
You can quickly pay through credit card or Stuvia-credit for the summaries. There is no membership needed.
Focus on what matters
Your fellow students write the study notes themselves, which is why the documents are always reliable and up-to-date. This ensures you quickly get to the core!
Frequently asked questions
What do I get when I buy this document?
You get a PDF, available immediately after your purchase. The purchased document is accessible anytime, anywhere and indefinitely through your profile.
Satisfaction guarantee: how does it work?
Our satisfaction guarantee ensures that you always find a study document that suits you well. You fill out a form, and our customer service team takes care of the rest.
Who am I buying these notes from?
Stuvia is a marketplace, so you are not buying this document from us, but from seller nassimathamnia. Stuvia facilitates payment to the seller.
Will I be stuck with a subscription?
No, you only buy these notes for CA$6.85. You're not tied to anything after your purchase.
Can Stuvia be trusted?
4.6 stars on Google & Trustpilot (+1000 reviews)
81113 documents were sold in the last 30 days
Founded in 2010, the go-to place to buy study notes for 14 years now