Samenvatting genoom deel 2

Deel 2 technieken en onderzoek

Inhoud
DNA analyse technieken....................................................................................................................2
1. PCR (aanwezigheid)........................................................................................................................2
2. Restricteeenzzymen (endonucleases) (aanwezigheid ean een sequente).......................................5
3. DNAegelelektroforese (aanwezigheid)............................................................................................7
4. Sanger sequencing (sequente).......................................................................................................8
5. Next generaton sequencing (sequente)........................................................................................9
RNA analyse technieken..................................................................................................................14
1. Inesitu hzybridisate (aanwezigheid/locate)...................................................................................14
2. cDNA maken (aanwezigheid/sequente (na sequencing))............................................................14
3. kwanttateee RTePCR (hoeeeelheid).............................................................................................15
4. RNAesequencing (sequencen).......................................................................................................15
Eiwit analyse technieken.................................................................................................................18
1. SDSePAGE......................................................................................................................................18
2. Western blotng...........................................................................................................................19
3 Fusieeeiwiten................................................................................................................................20
4 CoeIP, ChIP (en EMSA) GSTepull down............................................................................................21
5 Enzzymacteitet assazys (m.b.e. spectrofotometer).........................................................................24
DNA-manipulate technieken...........................................................................................................25
3. DNAeklonering:.............................................................................................................................25
4 Side directed mutagenesis.............................................................................................................27
5. Genomische banken en cDNA banken..........................................................................................28
6. (Oeer)expressie.............................................................................................................................29
7. Fusieeeiwiten en reporteregenen.................................................................................................30
8 RNAeinterferente dme shRNA’s....................................................................................................32
9. CRISPR/Cas9 gene editng.............................................................................................................33
........................................................................................................................................................35
Lac operon.......................................................................................................................................35




Hzybridisate is de basis eoor deze technieken en is het basenparen ean twee enkelstrengs
DNA of RNA.



1

,DNA analyse technieken
1. PCR (aanwezigheid)
PCR heef als doel om een gedeelte ean het
DNA te selecteren en daarna te
amplifceren. De eoorwaarde is dat je de
uiteinden ean het stuk dat je wilt
eermeerderen bekend is. Het stuk dat je
wilt eermeerderen kan max. enkele
duizenden badenparen groot zijn. PCR
werkt met een foward en reeerse primers.
PCR maakt gebruik ean een thermische
czycli. Er zijn 3 stadia te onderscheiden:
1. Denaturate: 20e30 seconden lang bij 95
graden. Bij deze temperatuur worden alle
waterstofbruggen eerbroken en gaat de DNA helix uit elkaar.
2. Hzybridizate ean de DNA primers: in deze stap gaan primers eia waterstofbruggen binden
aan de twee losse DNA strengen ean het target gen. De primer die aan de antsense streng
bindt en dezelfde nucleotden eolgorde heef als de sense streng wordt de forward primer
genoemd. De forward primer ziet het er zelfde uit als het stuk DNA waar je gen naar
interesse op zit. Deze stap eindt plaats bij een temperatuur ean 50e65 graden eoor ongeeeer
20e40 seconden.




3. DNA szynthese: eindt plaats bij 72 graden wat een optmale temperatuur is eoor DNAe
polzymerase. Het is een speciale polzymerase die tegen een hoge temperatuur kan genaamd
Taq polzymerase. In deze stap wordt eanaf de primer de enkelstrengs DNA strengen eerlengd
eanaf de primer. De primers binden aan de enkelstrengs DNA strengen. De amplicons (het
gedeelte wat je wilt hebben) nemen exponenteel toe en er zijn ongeeeer 20e40 czycli nodig.




2

,Benodigdheden PCR:
 DNAetemplate waarin het fragment zit wat moet worden geamplifceerd.
 Primers (kleine stukjes DNA). Primers moeten complementair zijn aan de losse
enkelstrengs DNA strengen en binden eoor en na het gen wat je wil amplifceren. Ze
moeten tussen 15e30 basenparen lang zijn en moeten 50% CG beeaten. Ze mogen
ook niet aan elkaar complementair zijn zodat er geen primerdimeren ontstaan.
Verder mag een primer ook niet complementair zijn in zich zelf en een secundair
structuur eormen. De smeltemperatuur moet boeen de 58 graden zijn.
 DNAepolzymerase
 DNTP’s
 Ionen zoals Mg2+ en K+ om de reacte te stabiliseren en zijn belangrijke coefactoren
eoor DNAepolzymerase.

Voeg als eerst water toe,
eereolgens het stuk DNA met
het gen naar interesse,
primers, bufer,
magnesiumchloride en dNTP's,
eoeg DNAepolzymerase als
laatste toe en meng grondig.
Daarna eoeg je het mengsel
toe in de PCR machine. De
machine bestaat uit een
thermoblok, waarbij de PCRe
buis of plaat wordt ingebracht en wordt onderworpen aan precieze
temperatuureeranderingen. Een eerwarmde deksel dat condensate eoorkomt, zodat er niks
ean het monster eerloren gaat. Als laatste een interface met een displazy eoor het instellen
ean de temperatuur en czyclustjden.

3

, Hot start PCR: omeat het achterhouden ean het polzymerase uit de reacte tot na de eerste
denaturatestap, die nietespecifeke amplifcate eoorkomt die zou kunnen optreden
eoorafgaand aan het fetsen.

Multplex PCR: pcr kan ook worden gemodifceerd eoor het gelijktjdig amplifceren ean
meerdere DNAesequentes door het gebruik ean meerdere primers in een enkele PCRe
reacte.

qPCR: In combinate met fuorescerende oligonucleotdeprobes kan PCR een techniek
worden die relateee of absolute nieeaus ean genexpressie kan meten of de hoeeeelheid
mRNA wordt geproduceerd eoor een bepaald gen of een bepaalde groep genen.

Genotzyping: PCR kan ook worden gebruikt om de aanwezigheid ean een bepaalde DNAe
sequente in een organisme te bepalen. Deze procedure wordt genotzypering genoemd.
Genotzypering kan bijeoorbeeld worden gebruikt om de authentciteit ean eismonsters te
bepalen door uit te zoeken of een soortspecifeke sequente in het monster aanwezig is.
Genotzypering wordt ook gebruikt in de forensische analzyse om te bepalen of DNA dat ter
plaatse ean een misdrijf wordt aangetrofen, oeereenkomt met een eerdachte.

Je kunt ook een gen in een plasmide zeten en dat in bacteriën inbrengen. De bacteriën
eermeerderen zich en daarmee ook het gen waar je geïnteresseerd in bent. Het nadeel ean
deze methode is dat het erg lang duurt en je een gelimiteerde gen groote kunt gebruiken.




4