Biofysische scheikunde
Hoofdstuk 1: principes van de spectroscopie
1. Inleiding
We wensen biologische processen te verstaan tot op het atomaire niveau, en gebruiken hiervoor technieken uit
de fysische chemie.
Wat is spectroscopie? Spectroscopie is de analyse van de interactie van elektromagnetische golven en materie.
3 types spectroscopie:
- Absorptie: Het eenvoudigste: we meten welk percentage van straling bij een bepaalde golflengte wordt
tegengehouden en zetten dit uit in de vorm van een spectrum. Geldt ook voor NMR spectroscopie.
- Secundaire effecten na absorptie. We kijken naar straling die eerst wordt geabsorbeerd en later
teruggegeven bij een verschillende golflengte. Het systeem absorbeert energie en gaat naar een
aangeslagen toestand en dan terug naar de oorspronkelijke toestand door het uitzenden van straling of
door warmte.
- Verstrooiing: We kijken naar de afbuiging van straling door moleculen (= wat het oog doet). Link naar
X-straal diffractie. Het aantal verstrooiing en afbuiging geeft informatie over het systeem.
2. Verstrooiing versus absorptie
Hoe gebeurt het? Welke chemische of fysische principes liggen aan de basis van de verschillende technieken?
Welk soort informatie kan worden bekomen? Hoe interpreten? Hoe meten?
Verstrooiing:
- Globale vorm (hoe ziet de molecule er globaal uit).
- Zeer beperkte resolutie, niet meer zien als de vorm, onnauwkeurig. Dikwijls niet meer dan een
gyratieradius. (Molecule draait tijdsafhankelijk, dat komt overeen met een straal van een bol).
- Meestal statisch, als tijdsgeresoleerd meestal over vrij lange tijdsperiodes. Lang ten opzichte van de
dynamica dat optreedt.
- Momenteel niet mogelijk om single moleculen te bestuderen (in de toekomst: free electron laser).
- Inefficiënt proces, niet mogelijk om te werken met 1 molecule want te inefficiënt, meerdere moleculen
nodig.
Uitzondering: X-straal.
Speciaal geval: verstrooiing door kristallen:
- Zeer gedetailleerd globaal beeld, alle atomaire posities. De golflengte is klein ten opzichte van de
interatomaire afstanden.
- Uitgemiddeld over een groot aantal moleculen.
- Statisch, in het beste geval snapshots. Weinig informatie over de dynamica, want de metingen duren
lang.
- Vaste stof.
- Gemakkelijk te interpreteren, groot voordeel is de foto van de elektronen densiteit.
Absorptie (omgekeerde van verstrooiing) + secundaire processen:
- Heel gedetailleerd en nauwkeurig beeld, maar zeer lokaal.
- Tijds-geresolveerd, snelle metingen (ms of korter).
- In oplossing maar soms mogelijk op single moleculen.
- Moeilijk te interpreteren, doordat het globaal beeld ontbreekt.
Speciaal geval: NMR spectroscopie
,Techniek voor macromoleculaire structuren.
- Proobt honderden individuele lokale omgevingen tegelijkertijd. De kernen van waterstof atomen op
moleculen, geeft informatie over de lokale omgeving.
- Leidt tot gedetailleerde 3D structuren.
- Informatie over macromoleculaire dynamica.
- In oplossing, maar niet mogelijk op single molecule.
Inefficiënte techniek, maar methode werkt wel.
3. Absorptie spectroscopie
Wanneer zal er absorptie optreden? Welke voorwaarden dat molecule bepaalde golflengte gaat absorberen?
Welk soort informatie levert dit op? Absorptie is gelinkt aan energetische transities in een molecule. Van lage
energie toestand naar een hoge energie toestand.
Absorptie proobt energieveranderingen in (bio)chemische systemen. Water heeft 10 elektronen, 10 protonen
en 6 neutronen. Er komt energie vrij wanneer de individuele atomen worden gemaakt. Zelfs bij 0K zijn er vibraties
aanwezig, de zero point vibrationele energy (ZPVE), laagste punt.
4. Het elektromagnetisch spectrum
Praktisch het ganse elektromagnetische spectrum is geschikt voor één of andere toepassing.
De processen in de kern hebben de hoogste energetische
processen.
5. Beschrijving van absorptie in termen van de klassieke mechanica
Hoe ziet een absorptiespectrum eruit? Kunnen we dat voorspellen en wat kunnen we uit het spectrum leren?
Een elektromagnetische golf gaat gepaard met een oscillerende elektrisch en magnetisch veld. Dit veld oefent
een dempend oscillerende kracht uit op aanwezige ladingen. Dit doet ons denken aan een ander systeem dat
goed gekend is in de fysica: aandrijving van een massa aan een veer met een oscillerende motor. Of het trillen
van een snaar onder een oscillerende aandrijving.
Absorptie gebeurt bij een resonantiegolflengte: de energie overeenkomend met de
golflengte van de elektromagnetische straling is gelijk aan een verandering in
energieniveau in het systeem. Komt overeen met de energie van een foton. Wanneer
de energie verschillend is van de resonantiegolflengte, dan is er geen absorptie,
maar wel andere vormen van interactie mogelijk, brekingsindex. Bijvoorbeeld
verstrooiing, waar er geen match nodig is.
Bij IR komt van vibrationele energie niveaus, binding is niet stijf, maar er zit variatie
op. Ons model: een gewicht aan een veer samen met demping en een oscillerende
aandrijfkracht. (Evenwicht perturberen). Als er geen demping aanwezig zou zijn,
dan zou er telkens meer energie blijven opbouwen en explodeert het systeem.
,Model: elektron gebonden in orbitaal trillend rond een evenwichtstoestand, demping komt overeen met
interactie met de omgeving. Aandrijfkracht is het elektrisch veld van de elektromagnetische straling.
Gewicht aan een veer en een oscillerende kracht toevoegen en verhogen, daarvan het
respons bekijken in spectrum als functie van frequentie. Dit wordt gedaan voor UV en licht.
Als er geen aandrijfkracht is, 1 keer hard trekken en zien hoe het systeem zich herstelt,
relactie in functie van de tijd. (NMR)
De resultaten zijn dezelfde, want frequentie is gelijk aan 1 over de tijd. Fourrier
transformatie.
Massa oscilleert rond een evenwichtspunt. Enerzijds is er de eigen
beweging van het elektron. Komt in ons model overeen met ons gewicht
dat rond zijn evenwicht oscilleert. Voor een kleine perturbatie rond de
evenwichtstoestand is dit in eerste benadering een harmonische oscillatie:
𝑑2𝑥
𝑚( ) = −𝑘𝑥
𝑑𝑡
Waarbij k de veerconstante is, komt overeen met wat voor soort binding het is. In dit geval is x evenredig met
het afstand tot evenwichtspositie. Formule afgeleid van (F = m a).
De oplossing van de vergelijking geeft: 𝑥 = 𝑥0 cos(𝜔0 𝑡). Waarbij x0 de amplitude is en ω0 de eigenfrequentie is
van het systeem. Voor een gewicht aan een veer is dit √𝑘/𝑚 met k de veerconstante en m de massa.
We voegen nu onze lichtbundel toe onder de vorm van een aandrijvende kracht met een frequentie ω, deze
frequentie kan gekozen worden. Deze oefent een oscillerende kracht uit van het type: 𝐹0 cos(𝜔𝑡). En onze massa
begint te bewegen. Dit zou moeten leiden tot een steeds groter wordende respons (steeds heviger oscilleren).
Daar dit niet gebeurt en er zich een steady state evenwicht instelt (ook bijvoorbeeld bij absorptie waar de OD
constant blijft), betekent dit dat er nog een kracht in het spel moet zijn die onze aandrijfkracht tegenwerkt. Dit
is een wrijvingskracht.
Wrijvingskrachten (interne wrijving, niet alleen met de omgeving) zijn evenredig met de
𝑑𝑥
snelheid van de beweging en nemen de vorm aan van: 𝑓 . Deze wrijving is afkomstig
𝑑𝑡
van de omgeving van het elektron. Er zijn nog andere ladingen (elektronen en kernen)
in de buurt die de beweging kunnen afremmen.
Het respons is uit fase, er is een faseverschil afhankelijk van de aandrijffrequentie. Het
respons opsplitsen in een deel in fase en een deel uit fase en de twee stukken apart
bekijken.
Spectroscopisch absorptie experiment: intensiteit van de lichtbundel blijft constant en
de golflengte wordt gevarieerd. De hoeveelheid fotonen meten die worden geabsorbeerd in functie van de
golflengte.
In het gewicht-aan-een-veer model komt dit overeen met: scannen van de frequentie van de aandrijfkracht, maar
behoud dezelfde amplitude. Kijken naar het respons van het gewicht onder invloed van variërende aandrijfkracht
en zie:
- Amplitude van de beweging van het gewicht verandert → absorptie van energie.
- Frequentie van de beweging van het gewicht blijft steeds gelijk aan de aandrijffrequentie (dus NIET
eigenfrequentie).
, - Faseverschil met aandrijfkracht varieert met aandrijffrequentie → dispersie.
Links in fase, rechts uit fase. De twee fasen zijn gelijk aan elkaar,
want zijn verwant. De uit fase afleiden geeft de in fase.
In het geval van resonantie is ω = ω0 (eigenfrequentie =
aandrijffrequentie). Hierbij kan een karakteristieke relaxatietijd τ
2𝑚
gehaald worden: 𝜏 = . Waarbij f de wrijvingscoëfficiënt is. De
𝑓
karakteristieke relaxatietijd komt overeen met de levensduur van
een energiestaat.
We zien echter ook nog iets anders in deze formule:
de breedte bij half maximum in de absorptieterm
geeft ons een waarde voor de relaxatietijd τ. Hoe
korter τ, hoe breder de absorptiepiek. Dit is wat we
vroeger al hebben vermeld: wanneer door
botsingen de levensduur van de geëxciteerde
toestand vermindert, verbreedt de absorptiepiek.
De relatie tussen bandbreedte en levensduur is
gemakkelijk te zien wanneer we gaan van gasfase
naar oplossing. Hierdoor blijft toewijzing in biologische systemen relatief moeilijk.
Spectroscopie is meestal in oplossing, maar spectra van vloeistoffen zijn moeilijker te
interpreteren dan die van gassen wegens de interactie tussen moleculen (banden in plaats
van individuelen absorptielijnen). Bij die interactie van moleculen vinden zich botsingen
plaats, waarbij er energie aan elkaar wordt doorgegeven en de afzonderlijke pieken gaan
versmelten naar bredere piek bij hogere concentratie. Vaak wordt er in water gewerkt
(biochemie), in spectroscopie is dat moeilijk en is er verlies van informatie.
Bij verdund gas zijn er verschillende energie transities, elektron gaat van bindingsorbitaal
naar anti-bindende orbitaal.
6. Absorptiespectrum van hemoglobine
Beschouw een ideale spectrofotometer. We meten het spectrum van hemoglobine in een waterige oplossing.
Onze bron bereikt alle golflengten met uniforme intensiteit, heeft een perfect monochromator en een detector
die alle golflengten even goed opvangt.
1. Radiogolven
𝜆 = 3 𝑘𝑚 − 30 𝑐𝑚, 𝜐 = 100 𝑘𝐻𝑧 − 1 𝐺𝐻𝑧 (109 𝐻𝑧) Bij allerlaagste frequenties gebeurt er niets. Vanaf 107 Hz
absorptieband (λ = 30 m) gebeurt er absorptie. Hemoglobine heeft dipool, en de snelheid waarmee het molecule
rond draait is 107 1/sec, matching de frequentie van de elektromagnetische straling. Er gebeurt resonantie en
hemoglobine molecule gaat beginnen oscilleren. De ladingsverdeling (door partiële ladingen van zijgroepen)
zorgt voor elektrisch dipoolmoment en gaat interageren met het elektromagnetische straling.
2. Microgolven (hogere frequenties)
𝜆 = 30 𝑐𝑚 − 300 µ𝑚, 𝜐 = 109 𝐻𝑧 − 1012 𝐻𝑧. Terug geen verdere absorptie tot 1011 Hz (λ= 3 mm). (FM radio +
TV = 50 – 100 MHz, GSM + wireless = 1-2 GHz).Vanaf 1011 Hz absorptieband te wijten aan de rotatiefrequentie
van watermoleculen (resonantie). Verhitting huid door GSM = fractie van een graad, veel minder dan direct
zonlicht. Door de straling gaat de molecule draaien, sneller doordat het klein is. Zorgt voor warmte (wrijving en
doorgeven van energie).
3. Infraroof en thermische energie – uitgedrukt in golfgetal ν
