HOOFDSTUK 6 Core DNA technologies: amplifying DNA, nucleic acid hybridization, and
DNA sequencing
6.1 Cloning DNA in bacterial cells
Stukje DNA uit DNA populatie amplificeren / cloneren. Dit is selectieve amplificatie.
Meerdere stukken of ganse genoom amplificiren, is niet selectieve amplificatie.
Cell based cloning: DNA polymerase van de cel zelf gebruiken.
Cell free cloning: in vitro polymerase gebruiken.
,Cell based cloning:
DNA uit bloed isoleren → opdelen in stukjes van werkbare grootte (Wanneer we DNA uit
bloedcellen isoleren zijn het zeer lange niet werkbare fragmenten. Je moet kleine werkbare
stukjes krijgen) → werkbare DNA fragmenten in vector ligeren → mengsel van DNA fragmenten
in vector, mixen met cellen bvb bacteriecellen of gisten, blootstellen aan elektrische puls
waardoor membraan van bacterie even opengaat → selectieve transformatie, er wordt ofwel 1
ofwel geen DNA molecule in de cel opgenomen → cellen die elk één DNA fragment bevatten,
afzonderen → van die cellen meerdere meerdere kopijen maken door celdeling → van die
celpopulatie DNA afzonderen.
,Naast een geschikte gastheercel is ook een replicon en dus vector nodig. We maken vaak
gebruik van extra chromosomale replicons, dat betekent dat vector onafhankelijk van
gastheergenoom gaat kunnen repliceren. Wanneer we een stukje naakt DNA in bacterie zouden
stoppen, kan het niet repliceren. Vector nodig waarop origine van DNA recplicatie zit. Humaan
DNA fragment dat in vector is gestoken (=recombinant DNA), gaat na transformatie dus na
opname in bacteriecel, oiv origine van DNA replicatie, kunnen repliceren.
Wanneer de bacteriecel deelt, krijgen we heel veel cellen die elk verschillende kopijen van het
DNA franmgent bevatten.
, Vectoren zijn vaak gemodificeerde plasmiden.
Circulaire plasmiden kunnen beter getransformeerd worden dan de lineaire plasmiden.
Bacteriofagen zijn de virussen van de bacterien.
Ook bacteriofagen kunnen zowel extrachromosomaal als geintegreerd in het
gastheerchromosoom bestaan.
Gistartificiele chromosomen met centromeer, ars en telomeer.
Cosmide vectoren dragen de cos sequentie.
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