Gentechnologie
Introductie
ORDERS OF MAGNITUDE
- Plantencellen: 50-70 µm
- Dierlijke cellen: 20-50 µm
- Gistcellen: 10-50 µm
- Bacteriën: 1-3 µm
- Virussen: 50-100 nm
Via elektronenmicroscopie
PROKARYOTES: MAIN STRUCTURES
- Bacteriën: verschillende maten en vormen
- 1-3 µm
- Afwezigheid nucleus met DNA
General organization of a bacteria
❖ Capsule (niet altijd) < polysacchariden
Bescherming tegen stress
❖ S-layer (niet altijd) < proteïnen
Onder capsulelaag
❖ Celwand
❖ Celmembraan
❖ Cytoplasma
❖ Ribosomen
❖ Chromosomen/plasmiden
❖ Flagellum, pili (niet altijd)
Structure of the cell wall: Gram-negative & Gram-positive bacteria
Gram-positief Gram-negatief
- 1 membraan - 2 membranen
- 1 dikke laag peptidoglycaan - Minder dik
- Behandeld met antibiotica - Hoge resistentie tegen
antibiotica
Escherichia coli bacteria (E.coli)
= meest gebruikte bacterie in genetic engineering (klonen, expressie en productie)
→ Gram-negatief: extra barrière om eiwitten uit cel te halen (transporters nodig)
→ Natuurlijke habitat: menselijke darm
→ Genetica en biochemie zeer goed gekend (volledig genoom gesequeneerd)
→ Veel moleculaire tools
→ Niet pathogeen: geen gevaar in labo (specifieke wel pathogene strains worden niet gebruikt in het lab)
→ Snelle groei: 1 deling / 20 min
o Na 16u al kolonie te zien met blote oog = 109 bacteriën → exponentiële groei
o Bij mislukking: makkelijk en snel opnieuw starten (i.vgl.m. ander soort bacteriën (bv. maand groei nodig))
→ DB3.1, BL21, DH5alpha, DH10B ,S17, Top10, …
1 Luna Willems – Biologie – VUB 2022-2023
,BACTERIAL CELWALL
PEPTIDOGLYCAAN (PG)
Om tot in cytoplasma bacterie te geraken: enzym breekt celwand af
(bv. om plasmiden eruit te halen)
- Polysaccharideketens gelinkt aan peptideketens
- Samengesteld uit afwisselend:
β (1 → 4) linked N-acetylglucosamine (GlcNAc) glycaan
N-acetylmuramic acid (MurNAc) glycan
LIPOPOLYSACCHARIDE (LPS) (!)
- Geankerd aan membraan langs buitenkant
Immuunsysteem (bv. mens) ziet dit als eerst
- Samengesteld uit:
Lipid A = endotoxine
o 2 glucosamines
o Acyl keten
o 1 fosfaat per glucosamine
Inner Core met negatieve ladingen
o Neutraliseren door Mg2+ eraan te binden
o EDTA: destabiliseert LPS door Mg2+ los te maken → membraan wordt partieel permeabel (zonder cel te
doden!) = belangrijk
Outer Core
O antigen
Nadeel LPS: Activatie immuunsysteem tijdens bv. protein purification
➔ Negatieve controle: geen LPS
➔ Positieve controle: enkel LPS
➔ Supplier 1: bij eiwitstijging → steeds hogere reactie
immuunsysteem → aanwezigheid contaminant/endotoxine
➔ Supplier 2: bij eiwitstijging → geen hogere reactie
Verschillende soorten celwanden
NOMENCLATUUR
❖ Gen: itrA (5’ – 3’)
o Italic, eerst kleine letter, op einde hoofdletter (meestal 4 letters)
o A gene is expressed
❖ Proteïne: ItrA (N-term & C-term)
o Niet italic, eerste en laatste letter een hoofdletter (meestal 4 letters)
o A protein is produced
❖ Escherichia coli / E. coli
o Italic, eerste letter een hoofdletter, de rest kleine letters
o Bacteria are cultivated
o Eerst volledige naam, later in tekst afkorting
2 Luna Willems – Biologie – VUB 2022-2023
,EXAMENVRAGEN
1. Wat is de gemiddelde grootte van eukaryote cellen, prokaryote cellen en virussen ?
2. Waarom werd de bacterie Escherichia coli veel gebruikt voor genetische manipulatie?
3. Wat is, met betrekking tot lipopolysaccharide, het mogelijke nadeel van het gebruik van bacteriën voor de productie van
proteïnen van medisch belang?
4. Leg de wetenschappelijke nomenclatuur uit om de naam van een gen, een eiwit en een bacterie te schrijven met een
voorbeeld van uw keuze. Associeer aan elk van hen het concept "expressie" of "productie" of "cultivatie".
Part 1A: DNA, modification enzymes and cloning strategies
DNA STRUCTUUR
= Deoxyribonucleic Acid
❖ 2 polynucleotidenketens
❖ Anti-parallel
❖ RIGHT handed
❖ 2 nm diameter
❖ Major en minor groove
❖ Oriëntatie altijd 5’ → 3’
o 5’: fosfaatgroep
o 3’: OH
❖ Polymerisatie dmv ligase: 5’ aan 3’ plakken
❖ Fosfodiester bindingen (covalente bindingen): nucleotiden aan elkaar op 1 streng (phosphatebackbone)
❖ Waterstofbruggen: nucleotiden aan elkaar tussen 2 strengen
o A-T: 2 bruggen & C-G: 3 bruggen (sterker)
▪ Belangrijk voor design primers & PCR
❖ Grootte DNA fragment: in basenparen (bp) (of kilobasepairs (kb) → eerder voor eiwitten)
Verschil nucleosiden – nucleotiden
Nucleosiden Nucleotiden
- Suiker met 5 C’s (pentose = desoxyribose) - Suiker met 5 C’s (pentose = desoxyribose)
- Nitrogenous base - Nitrogenous base
- Geen fosfaatgroep - WEL fosfaatgroep: op 5’
- Kan gefosforyleerd worden → °nucleotide
➔ Nucleotiden aan elkaar gelinkt via
fosfodiesterbindingen (tussen 5’ en 3’)
Fosforylatie nucleoside → nucleotide: trifosfaten
→ 3 fosfaten nodig: enkel alfa blijft, pyrofosfaat (beta +
gamma) komt vrij
→ DNA visualiseren → alfa labelen
→ Eiwitten visualiseren → gamma labelen = fosfaten die
gebruikt worden om eiwitten bv. te activeren
3 Luna Willems – Biologie – VUB 2022-2023
,DNA POLYMERISATIE
Reactie gebeurt op 3’ OH → trifosfaat nucleotide wordt vastgehangen aan 5’
→ °elongating chain
Pyrosequencing = trifosfaat toegevoegd waarvan pyrofosfaat terug vrijkomt
DNA MODIFICATION ENZYMES
❖ Ligase
❖ Klenow Fragment
❖ Alcaline Phosphatase
❖ Polynucleotide Kinase
❖ DNase
LIGASE
Als DNA gesneden wordt dmv restrictie-enzymen → °sticky ends: DNA klikt weer vanzelf in elkaar, maar er blijven gaps
➔ Complementaire basen binden met elkaar, maar nog niet covalent
gebonden
➔ Dus: onstabiel + valt weer uit elkaar bij T verandering
➔ Oplossing: DNA ligase om gap te dichten
o T4 DNA ligase & E. coli ligase
o Katalyseert vorming fosfodiester/covalente binding tussen 5’ fosfaat en 3’ OH (op 1 streng, niet tussen strengen)
▪ = DNA polymerisatie proces (pyrofosfaat etc…)
o ATP = cofactor
▪ Activeert 5’ fosfaat
o In labo: benodigdheden als je self-ligation wil bekomen: compatible ends:
▪ Complementaire strengen (anders werkt ligase niet!) + ATP
▪ OF blunt ends: geen complementairiteit nodig, altijd compatibel met elkaar + ATP
o Oriëntatie!!
▪ Vooral bij blunt ends: je zou ene fragment voor andere kunnen zetten waardoor promotorregio verkeerd
(of net goed) komt te staan → belangrijk te weten tijdens bv. klonen
Restrictie-enzymen:
➔ Verschillende restrictie-enzymen kunnen verschillende compatibele eindes genereren
➔ Belangrijk te weten welk enzym je nodig hebt zodanig dat je net naast het gene of interest snijdt
➔ Voorbeelden: (telkens fosfaat
4 Luna Willems – Biologie – VUB 2022-2023
,KLENOW FRAGMENT
= deel van DNA polymerase I van E. coli, eraf gehaald dmv proteolyse
❖ Synthese van single stranded (SS) DNA
❖ Wordt gebruikt als DNA fragmenten geen compatibele eindes hebben, maar toch aan elkaar gehangen moeten worden
❖ Veel applicaties: sequencing, mutagenese, blunting, cDNA
❖ 2 manieren
o Fill-in Reaction: extra nucleotiden toevoegen (= wat DNA polymerase doet) → °blunt ends
o Removal of protruding ends: nucleotiden eraf knippen (nuclease activiteit) → °blunt ends
▪ Nadeel: verlies van basen → frame shift mogelijk
ALCALINE PHOSPHATASE (AP)
Afkomstig van…
→ Bacterial alkaline phosphatase (BAP)
→ Calf intestinal alkaline phosphatase (CIP)
→ Shrimp alkaline phosphatase (SAP)
Stel: een plasmide (vector) gesneden door restrictie-enzym EcoRI
→ °sticky ends
➔ Je wil een gene of interest in het plasmide plakken
➔ Probleem: grotere kans dat plasmide aan zelf-ligatie doet (door sticky ends) → gene of interest geraakt niet in plasmide
➔ Oplossing: AP toevoegen op 5’ (beide kanten) van de vector (plasmide)
o 5’ fosfaat wordt aan beide kanten weggehaald → zelf-ligatie NIET meer mogelijk
o Gene of interest bevat wél 5’ P → wordt in plasmide opgenomen
➔ Oriëntatie!!
POLYNUCLEOTIDE KINASE (PNK)
❖ Nodig indien er geen fosfaatgroep aanwezig is, maar je wil fragmenten toch aan elkaar kunnen ligeren (P nodig!)
o Bv. na defosforylatie of een synthetisch gemaakt molecule
❖ PNK katalyseert de transfer van een gamma fosfaat van ATP naar 5’ van DNA/RNA → kinase
activiteit
❖ Gebruik van PNK’s
o Fosforyleren van linkers, adaptors en primers, DNA fragmenten, PCR producten…
o Radiolabelling oligonucleotiden (kort stuk SS DNA) meestal met 32P
o Geïnhibeerd door ammonium ionen (NH4+)
DNAse
❖ Snijden van DNA
❖ Nucleases voor DNA of RNA (endonuclease = in DNA ; exonuclease = uiteindes DNA)
o Klieving van fosfodiester binding (= de covalente binding die DNA stabiliseert)
o Op een non-specifieke manier: gelijk waar in DNA (i.t.t. bv. restrictie-
enzymen)
❖ Meest gebruikte:
o DNAse I: klieving van DS of SS DNA
▪ RNA zo isoleren van DNA
▪ Analyseren van DNA-eiwit interacties via DNAse footprinting
▪ Nicking van DNA voorafgaand aan radiolabelling door nick translatie
o RNAse A
5 Luna Willems – Biologie – VUB 2022-2023
,CLONING TECHNIQUES
RESTRICTION ENZYMES & LIGATION
Origin and biological function of restriction-enzymes
❖ Geproduceerd in bacteriën
❖ Partiële bescherming tegen vreemd DNA (fagen, conjugatieve plasmiden…) → bv. bacteriofaag injecteert DNA →
restrictie-enzymen knippen DNA er terug uit
o Bescherming tegen knippen in bacterieel DNA: DNA-methylatie (CH3)
Verschillende restrictie-enzymen + zie eerder!
Isoschizomeren = restrictie-enzymen die dezelfde sequentie herkennen, maar niet noodzakelijk op exact dezelfde plaats binnen
die sequentie klieven
Temperatuur = belangrijk voor restrictie-enzymen!
➔ Bv. E.coli bij 37°C
➔ Bv. SmaI bij 20°C
➔ KOUD bewaren! (-20 – 4°C) (stabiliteit)
Herkenning sequenties
➔ Lengte van 4, 5, 6 of 8 bp + meestal palindroom
Hoe gene of interest in plasmide krijgen (zie eerder)?
➔ Restrictie-enzymen: endonucleasen → knippen DNA → °3’OH en 5’P uiteindes
➔ Ligase: bindt twee DNA fragmenten
Hoe zorg je ervoor dat een plasmide een gene of interest wil bijhouden?
➔ Selective pressure
o Bv. een gen dat resistentie geeft tegen bep. antibioticum (R) + gene of interest → bacterie in medium met dat
antibioticum plaatsen → °recombinante vector met gene of interest
Hoe kans op juiste oriëntatie verhogen?
Ipv één, twee verschillende restrictie-enzymen gebruiken die compatibel zijn
(bv. EcoRI en NotI)
o MCS = multiple cloning sites = plaats met veel
restrictieplaatsen voor de enzymen
o Knippen beiden 1 uiteinde in zowel plasmide als gene of
interest → °specifieke uiteindes
▪ EcoRI uiteindes enkel met elkaar te binden
▪ NotI uiteindes enkel met elkaar te binden
6 Luna Willems – Biologie – VUB 2022-2023
, Restriction-ligation: comments
→ Slechts één insertie van een gene of interest per cloning cycle → meerdere inserties = meerdere cloning cylcles
→ Inefficiënt voor insertie van grote fragmenten
→ Plasmide design kan gelimiteerd worden door een gelimiteerde beschikbaarheid van restrictie-sites
→ Als de restrictie-site in het midden van de insert is, kan dat enzym niet gebruikt worden want dan wordt de insert
verteerd
Hoe kan je weten of een gene of interest degelijk in het plasmide geraakt is: op de juiste plaats en juiste oriëntatie?
PCR-based approach:
➔ Let op voor mutaties!
➔ Altijd ook aan sequencing doen om zeker van te zijn dat je bv. geen mutatie hebt
o Anders kan bv. eiwit niet gevormd worden
3 methodes a.d.h.v. primers
1) Insert-specific: primers binden op insert → na amplificatie heb je het
gewenste stuk DNA, maar je weet niet waar het zich bevindt in het
plasmide = screening of presence of insert
2) Backbone-specific: primers binden buiten de insert, op backbone van
plasmide → als je na amplificatie een groot aantal kb hebt, dan zit het
gene of interest erin. Als je slechts bv. 100 bp hebt, niet. Maar je insert
wordt in dit geval niet herkent, geen bewijs dus dat insert erin zit
3) Orientation-specific: combinatie van 1 & 2: primer dat insert herkent en
primer dat op backbone bindt → bewijs voor locatie/grootte/oriëntatie
fragment
Negatieve controle = geen insert, maar self-ligation
➔ Bij nr.3: bovenste pijl zal nergens aan kunnen binden
Restriction based
➔ Is nogal sensitief en specifiek (met primers die je kiest), dus PCR blijft beter
Sequencing based
➔ Altijd belangrijk om te doen, SAMEN met PCR
➔ Pas op voor silent mutations! → expressie eiwit blijft dezelfde
THE GATEWAY-SYSTEM
= een universele cloning techniek, gebaseerd op de λ faag recombinatie:
- Site-specific recombination
- Faag injecteert DNA in bacterie (bv. E.coli) → circularisatie → herkent site DNA
(attB) van bacterie → recombinatie met attP van DNA faag (att: attachment, P:
phage, B: bacteria)
Super specifiek: verschillende attB sites herkennen enel attP sites!
- Resultaat: integratie van het faaggenoom in het bacterieel genoom → °attL en attR sites (left & right)
7 Luna Willems – Biologie – VUB 2022-2023
