Samenvatting van hoofdstuk6: Core DNA Technologies , Moleculaire Genetica door T. Voet en op basis van mijn notities en slides van de les. Voor de richting Biomedische Wetenschappen.
● Cel-gebaseerde klonering
○ Complex DNA-staal wordt in kleine stukjes verdeeld van werkbare grootte
vervolgens worden vectoren/genetisch gemodificeerde plasmiden en
gastheercellen worden gebruikt om DNA mengsel te fractioneren,
vermenigvuldigen en analyseren.
■ Transformatie van stukjes DNA,
via bv. elektroporatie = worden
elk afzonderlijk in cellen
(proces is dus selectief)
gebracht, vaak in snel delende cellen, bv. E. Coli
● Afzonderlijke cellen isoleren en cultiveren ⇒ DNA-opzuiveren
○ Vector
■ Bevat replicon-molecule dat er voor zorgt dat de DNA-sequentie kan
repliceren in de gastheer
■ Sommigen kunnen in een bacteriecel repliceren om hoge
kopie-aantallen te bereiken + bacterie die gekloond DNA bevat deelt
snel ⇒ groot aantal identieke bacterieklonen met elke vele vectoren
met vreemd DNA
■ Plasmiden als vector
● Niet essentiële DNA-moleculen die onafhankelijk van het
gastheerchromosoom repliceren
● Integreren niet in chromosoom gastheer = extrachromosomaal
● Meestal circulair
● Verschillenden kunnen naast elkaar bestaan
● Episomen = integreren in chromosoom bacterie of
extrachromosomaal
■ Bacteriofaag als vector
● Bestaan extracellulair maar hebben gastheer nodig om te
reproduceren ⇒ besmetting en lysis
● DNA/RNA genoom ingepakt in proteïne mantel
● Profagen = integreren in chromosoom bacterie of
extrachromosomaal
■ Genetisch gemodificatie is nodig, zodat we efficiënt een vreemd DNA
eraan kunnen verbinden en zodat getransformeerde cellen
gemakkelijker herkend worden
1
, Plaatsen van DNA stukje in vector
Gebruik van type 2 restrictie-nucleasen ⇒ knippen
DNA op plaatsen waar ze specifieke palindromen
(van 5 naar 3 leest hetzelfde als van 3 naar 5)
herkennen + zorgen voor uniforme uiteinden ⇒ kan
overhang (zie afbeelding, voordeel: ‘sticky ends’ =
door basenparing kunnen deze gemakkelijk opnieuw
verbonden worden door DNA-ligase ) of blunt zijn
● Natuurlijk doel = bacteriën beschermen tegen ziekteverwekkers, bv. bacteriofagen
● Plasmidevectoren bevatten klonering sites PL = opeenvolging van
restrictie-herkenningssequenties waar verschillende types nucleasen kunnen gaan
knippen ⇒ waar er geknipt is kan nu gemakkelijk een humaan stukje DNA gebracht
worden
○ Komen ook natuurlijk voor ⇒ natuurlijk doel
○ Bv. pUC19 ⇒ PL zit tussen LacI (repressor van Lacz’) en LacZ’, mechanisme om
te bepalen of er nu een humaan DNA stukje is opgenomen of niet
■ Werking:
- Bij toevoeging van IPTG aan non-recombinant DNA wordt LacI
geïnhibeerd en kan Lacz’ tot expressie komen ⇒ translatie tot
actief bèta-galactosidase ⇒ wanneer men dan X-gal toevoegt
aan de voedingsbodem, kleuren deze cellen blauw
- Recombinant DNA leidt niet tot expressie van Lacz’ ⇒ in
frame: te groot alfa-fragment waardoor inactief
bèta-galatosidase OF niet in frame waardoor ook inactief
Transformatie en fysiek scheiden van celkolonies
Op vector wordt antibioticum-resistentie gen geplaatst + transformatie in cellen die gevoelig
zijn voor antibioticum ⇒ cellen cultiveren op voedingsbodem met antibioticum waardoor
enkel de cellen met het recombinant DNA overleven. BELANGRIJK: mengsel goed
uitspreiden op petrischaal zodat kolonies, 1 kolonie groeit vanuit 1 cel elke cel heeft ander
ander DNA-fragment) goed verspreid zijn en dus makkelijk pikbaar zijn. Nu kan men uit
verschillende kolonies verschillende stukjes DNA opzuiveren.
⇒ Toepassingen
Aanmaak van genomische DNA-kloonbibliotheken
- Bevat verschillende DNA-klonen die tezamen alle verschillende DNA-sequenties in
het genoom omvatten.
2
Voordelen van het kopen van samenvattingen bij Stuvia op een rij:
√ Verzekerd van kwaliteit door reviews
Stuvia-klanten hebben meer dan 700.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet je zeker dat je de beste documenten koopt!
Snel en makkelijk kopen
Je betaalt supersnel en eenmalig met iDeal, Bancontact of creditcard voor de samenvatting. Zonder lidmaatschap.
Focus op de essentie
Samenvattingen worden geschreven voor en door anderen. Daarom zijn de samenvattingen altijd betrouwbaar en actueel. Zo kom je snel tot de kern!
Veelgestelde vragen
Wat krijg ik als ik dit document koop?
Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.
Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?
Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.
Van wie koop ik deze samenvatting?
Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper EmilieBMW. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.
Zit ik meteen vast aan een abonnement?
Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €5,00. Je zit daarna nergens aan vast.
