Samenvatting Biotechnologie - Deel 2

KC4 Microbiële biotechnologie

Micro-organismen

- Organismen die te klein zijn om met het blote oog te zien
o Prokaryoten: bacteriën en archaea
o Eukaryoten: schimmels en protsten

Micro-organismen en biotechnologie

- Gebruikt voor duidenden jaren
- Er is een enorme diversiteit
o 1% van alle bacteriën is bekend
o 10% van alle schimmels is bekend
- Ze hebben een enorme metabolische diversiteit
o Ze kunnen gebruik maken van veel bronnen
o Ze produceren ook veel secundaire metabolieten waar wij wat aan hebben
- Snelle groei
- Genetsch toegankelijk
- Belangrijke modelsystemen zijn E. coli en S. cerevisae (gist)

Bacteriën

- Ze komen voor in verschillende vormen




- Gramkleuring
o Gram positeve bacteriën
 Celwand bestaat uit een dikke laag peptdoglycaan
 Kleurt paars
o Roze: gram negatee
 Celwand bestaat uit een dunne laag
peptdoglycaan met nog een extra
celwand van lipopolysaccharide en eiwit
 Kleurt roze
- Er kunnen verschillende onderdelen van micro-organismen gebruikt worden bv de
hele cel maar ook bv een product van zo’n organisme


Voedselproducte

- Oudste vorm van biotechnologie
- Micro-organismen breken suikers ae onder
anaerobe condites
- Vormen van eermentate: melkzuur en alcohol




1

,Toepassing van enzymen

- Gebruikt voor voedselproducte tot moleculair biologisch onderzoek
- Restricte enzymen, ligase, taq polymerase
- Cellulases voor stonewashed jeans
- Proteases voor wasmiddelen en bier
- Lactases voor lactose vrije melk

Enzymen van extremofelen zijn nuutg doordat ze hoge temperaturen kunnen doorstaan(archaea)

- Eerst moeten de enzymen geïsoleerd worden
o Isolate van organismen uit extreme omstandigheden
o Isoleren van DNA uit extreme omstandigheden, kloneren en sequensen

Inbrengen van genen in bacteriën

- Door plasmiden omdat deze makkelijk te isoleren zijn
- Transeormate door
o CaCl2 behandeling
o Electroporate

CaCl2 methode

Eerst moeten de cellen competent gemaakt worden door een overnacht cultuur te nemen en deze in
een ijskoude CaCl2 oplossing te plaatsen. Door toevoeging van glycerol bevriezen de cellen.

- Transeormate
o De competente cellen worden gemengd met plasmiden en op ijs gezet
o Het mengsel krijgt een korte hite shock (42°C) voor één minuut
o Hierna wordt het voor een uur geïncubeerd bij 37°C
o De cellen worden uitgeplaat op een voedingsbodem met antbiotcum

Men denkt dat CaCl2 het membraan destabiliseert en dat door de hiteshock kleine openingen in de
membraan komen waardoor de plasmide kan worden opgenomen. Deze methode werkt goed voor
E. coli, maar minder voor andere bacteriën oe eukaryoten micro-organismen

Elektroporate

- De cellen en de plasmiden worden gemengd en in een cuvet geplaatst
- Ze krijgen een elektrische shock waardoor het membraan tjdelijk permeabel wordt en de
plasmide wordt opgenomen
- Ook hier worden ze een uur in een medium geplaatst bij 37°C
- Hierna worden de cellen uitgeplaat op een voedingsbodem met antbiotcum
o Voordelen
 Snel

2

,  Efciënt
 Ook voor
eukaryote cellen

Mutates maken in bacteriën

- Bacteriën komen voor in grote
aantallen en delen snel en veel
- Bacteriën zijn haploïd dus
mutates komen meteen tot
uitng en worden doorgegeven
aan de volgende generate
- Mutates vinden spontaan plaats,
maar kunnen ook geïnduceerd worden door Uv-licht oe mutagene stofen
- Soms kan je door mutates ook ongewenste eigenschappen uitschakelen
o Het gaat hier om random mutates, dus je weet niet precies welke genen
uitgeschakeld worden

Gericht uitschakelen door homologe recombinate

- Om gen X uit te schakelen, wordt deze gekloneerd op een plasmide
- Gen X wordt opengebroken door er een ander gen in te plaatsen
- De plasmide wordt lineair open geknipt, deze kan zo niet meer repliceren
- Een deel van de plasmiden zal verloren gaan, maar bij een deel zal homologe
recombinate optreden en gen X uitgewisseld worden
- Hierna zal het chromosoom gaan delen en het lineaire plasmide zal verloren gaan
- Dit zal bij een klein percentage gebeuren, maar selecte is mogelijk door een antbiotcum
- Het kan ook gebruikt worden voor het inbrengen van een nieuw gen in het chromosoom

Producte van insuline in E. coli

- Insuline
o Eiwithormoon
o Gemaakt in pancreas
o Reguleert de glucose concentrate in het bloed
- Type I diabetes: gekort aan insuline
- Verleden: geïsoleerd uit de pancreas van varkens en koeien
o Deze insuline was anders dan humaan insuline
- Producte in bacteriën was lastg omdat het eiwit bestaat uit
twee ketens, de α- en de β-keten, die met zwavelbruggen aan elkaar zijn gekoppeld
- In de mens wordt het geproduceerd als een lange keten, bestaande uit de twee ketens met
een stuk ertussen wat door een protease verwijderd wordt die niet in bacteriën aanwezig is
- Om deze reden hebben ze beide ketens in verschillende
plasmiden tot expressie gebracht, achter het β-galactose gen
- Hierna wordt het β-galactose gen door afniteit
chromatografe verwijderd en worden de ketens onder
oxiderende omstandigheden samengevoegd

Fusie eiwiten

- Fuseren van een eiwit gen met een ander gen van een eiwit ‘tag’

3