Isolatie nucleïnezuren
isolatie DNA
Step 1: Cell Lysis
• Openbreken celwand, plasmamembraan & kernmembraan
• Denaturatie & degradatie eiwitten (e.g. nucleases)
Step 2: DNA binding
• Blootleggen (-) lading DNA backbone
• Vormen van zoutbruggen tussen DNA (-) en silica (-)
Step 3: Washing
• Wassen van kolom om eiwitresten en zouten te verwijderen
Step 4: Elution
• Verbreken van zoutbruggen tussen DNA en silica
• Opvangen gDNA
Isolatie van RNA zelfde manier als bij DNA, maar:
- DNA contaminatie is zeer waarschijnlijk
- RNA is zeer instabiel TRIZOL stabiliseert RNA na isolatie meteen snap freeze van
samples in vloeibare stikstof
- RNase zeer stabiel DEPC toevoegen om te inactiveren
Endonuclease = knipt in het midden
Exonuclease = knipt aan het uiteinde
Nucleases knippen tussen deoxribose en fosfaatgroep (de fosfo-diester
verbindingen)
Restrictie enzymen maken viraal DNA onschadelijk knippen eigen DNA niet omdat deze
gemethyleerd is.
Isoschizomeren:
Verschillende enzymen met dezelfde herkenningssequentie en zelfde manier van knippen
Neo-isoschizomeren:
Verschillende enzymen met dezelfde herkenningssequentie maar verschillende manier van knippen
, Ligases
Sticky-end dna streng waar een complementair deel aan kan plakken
Blunt-end niet sticky-end de nuclease knipt in een rechte lijn en blijft niet over om nog iets aan te
plakken
Er is een palindroom nodig om te kunnen knippen
Gelelektroforese:
Scheiding op basis van grootte van DNA moleculen, kleine fragmenten lopen het snelst.
Lading van DNA negatief
SYBRsafe zorgt ervoor dat het DNA zichtbaar wordt in de gel. Doordat het tussen basen hecht het
DNA is te zien als bandjes op de gel.
Agarose gel concentratie agarose bepaald dichtheid.
Laag % voor scheiding grote fragmenten.
Hoog % voor scheiding kleine fragmenten.
Polyacrylamide gelelektroforese (PAGE)
Veel hogere dichtheid dan agarose scheiding tot op 1 nucleotide
nauwkeuring!
Ontwikkeld voor eiwitscheiding
Verticaal
Pulse-field elektroforese voor zeer grote fragmenten
Afwisselende richting van elektrisch veld, DNA fragmenten moeten zich steeds opnieuw richten
(remt af) fragmenten tot 2 mb gescheiden
isolatie DNA
Step 1: Cell Lysis
• Openbreken celwand, plasmamembraan & kernmembraan
• Denaturatie & degradatie eiwitten (e.g. nucleases)
Step 2: DNA binding
• Blootleggen (-) lading DNA backbone
• Vormen van zoutbruggen tussen DNA (-) en silica (-)
Step 3: Washing
• Wassen van kolom om eiwitresten en zouten te verwijderen
Step 4: Elution
• Verbreken van zoutbruggen tussen DNA en silica
• Opvangen gDNA
Isolatie van RNA zelfde manier als bij DNA, maar:
- DNA contaminatie is zeer waarschijnlijk
- RNA is zeer instabiel TRIZOL stabiliseert RNA na isolatie meteen snap freeze van
samples in vloeibare stikstof
- RNase zeer stabiel DEPC toevoegen om te inactiveren
Endonuclease = knipt in het midden
Exonuclease = knipt aan het uiteinde
Nucleases knippen tussen deoxribose en fosfaatgroep (de fosfo-diester
verbindingen)
Restrictie enzymen maken viraal DNA onschadelijk knippen eigen DNA niet omdat deze
gemethyleerd is.
Isoschizomeren:
Verschillende enzymen met dezelfde herkenningssequentie en zelfde manier van knippen
Neo-isoschizomeren:
Verschillende enzymen met dezelfde herkenningssequentie maar verschillende manier van knippen
, Ligases
Sticky-end dna streng waar een complementair deel aan kan plakken
Blunt-end niet sticky-end de nuclease knipt in een rechte lijn en blijft niet over om nog iets aan te
plakken
Er is een palindroom nodig om te kunnen knippen
Gelelektroforese:
Scheiding op basis van grootte van DNA moleculen, kleine fragmenten lopen het snelst.
Lading van DNA negatief
SYBRsafe zorgt ervoor dat het DNA zichtbaar wordt in de gel. Doordat het tussen basen hecht het
DNA is te zien als bandjes op de gel.
Agarose gel concentratie agarose bepaald dichtheid.
Laag % voor scheiding grote fragmenten.
Hoog % voor scheiding kleine fragmenten.
Polyacrylamide gelelektroforese (PAGE)
Veel hogere dichtheid dan agarose scheiding tot op 1 nucleotide
nauwkeuring!
Ontwikkeld voor eiwitscheiding
Verticaal
Pulse-field elektroforese voor zeer grote fragmenten
Afwisselende richting van elektrisch veld, DNA fragmenten moeten zich steeds opnieuw richten
(remt af) fragmenten tot 2 mb gescheiden
