Advanced Labtools
Life Sciences – Hogeschool Utrecht
Semester 6
Biochemische technieken
Introductie Biotechniques Part I
A = precursor
D = eindproduct
B & C = intermediaire metabolieten
Tussenproducten kunnen ook
geanalyseerd worden om wat te zeggen
over eindproduct. Ook andere receptoren
of signaalstoffen die bij de pathway horen
Je wilt uiteindelijk eindigen met een fractie van
zoveel mogelijk eiwit van interesse wilt zonder
verontreinigingen
Eindproduct analyseren m.b.v. ELISA, SDS en
Western Blot etc. maar ook tussenproducten al
analyseren
Toename van zuiverheid gaat wel ten kosten
van totale opbrengst, de yield. Je verliest
namelijk bij elke stap materiaal
Weefselhomogenisatie, cel lysis en fractionering
Het type methode van preparatie hangt af van welk soort materiaal
je mee begint.
Celsuspensies uit een celkweek kunnen op een zachte manier
behandeld worden. Stukjes weefsel kunnen harder behandeld
worden om te homogeniseren.
Osmotische shock = cellen eerst in hypertone oplossing. Dan
hypotone oplossing waardoor celwanden knappen
Vries-dooi cyclus = door temp. verschil kunnen ijskristallen
ontstaan waardoor celwand kapot
Mechanische methoden veroorzaken allemaal warmte waardoor
eiwitten denatureren
, Sonicators zorgen via een
metalen probe voor ultrasone
golven die cellen kapot maken.
Een ultrasoon waterbad zorgt
voor een iets zachtere
methode van celdisruptie
Homogenisers zorgen ervoor dat cellen tegen de
glaswand gedrukt worden waardoor ze kapot
gaan. Is minder krachtig dan een blender of
rotor-stator
Gebruikt wanneer intacte organellen nodig zijn
Als een enzym vrijkomt wordt het blootgesteld aan
allerlei factoren die voor denaturatie kunnen zorgen.
Daarom buffers gebruiken met reagentia die mogelijke
schadelijke effecten te niet doen. Daarnaast voorkomen
om op ijs of in koude omgeving te werken, anders ook
verlies van activiteit
Lijst van componenten die aanwezig kunnen zijn in
homogenisatiebuffer. Maar ook componenten die
later tijdens eiwitzuiveringsstappen belangrijk zijn in
oplossingen staan hier genoemd.
Buffer dient als vervanging voor het intracellulaire
buffersysteem dat nu niet meer aanwezig is
Wel weten welke stofjes waar voor zijn
Bij cellysis komen ook proteasen vrij die normaal
verpakt zitten in lysosomen.
Daarom gebruik van protease inhibitors
, Lysis technieken worden ook vaak
gecombineerd voor optimaal resultaat
In deze fase is het belangrijk om een maximale
opbrengst van intact eiwit na te streven
Vaak eerst centrifugeren en pellet en supernatant
scheiden. Kan ook in stapsgewijze methode waarbij
grote organellen van kleine eiwitten worden
gescheiden in meerdere stappen
Bij stapsgewijs isoleren ga je supernatant bij steeds
hogere snelheid centrifugeren. Opnieuw scheiden en
opnieuw centrifugeren enz.
Tot de fractie waar gewenste eiwit/organel in zit
Andere manier om organellen of andere
componenten te scheiden
Verschillende concentraties sucrose; de deeltjes
komen in de fractie terecht waar de dichtheid
overeenkomt met de dichtheid van het medium
Kunnen tot 50.000 rpm met krachten van
100.000 g. Soms ook dagenlang afdraaien voor
hele kleine organellen of macromoleculen
, Rechts is geschikt voor gradiënt methode. Dat
kan niet met de linker, want dan zakken de
verschillende gradiënt in door resuspensie.
Verschillen in buizen moeten minder dan 0,1
gram zijn. Rotors mogen geen haarscheuren
hebben, dienen juist te worden verwisseld
schoongemaakt en bewaard worden.
Na centrifugeren wil je zoveel mogelijk niet-
eiwit componenten kwijtraken. Kan met behulp
van detergentia (voor membranen en lipiden) of
met DNAses en RNAses (voor nucleïnezuren)
Soms noodzakelijk om zouten te verwijderen of buffers aan te
passen. Te zuiveren sample dan in een semipermeabele zak
doen en in bekerglas met gewenste buffer hangen.
Dan bepaalde cut-off waarde; tot een bepaalde grootte kunnen
moleculen en eiwitten wel door de membraan heen.
Filtratiemethode waarbij druk- of centrifugegradiënten leiden
tot een scheiding door een semipermeabel membraan.
Retentaat: komt niet door het membraan heen
Permeaat (filtraat): komt wel door het membraan heen
Op die manier scheiding en ook concentratie van het sample
, Voordat je begint aan de zuivering moet je eerst een
zuiveringsstrategie hebben
Eiwitzuivering - Uitzoeken wat er bekend is over te isoleren eiwit
- Wat zijn de fysische en biologische eigenschappen
- Moleculaire massa en het iso-elektrisch punt bepalen
voor als je ion-exchange chromatografie wilt doen
- Hoe hydrofoob is het eiwit?
- Eventuele reactieve groepen van het molecuul/eiwit
- …
Nagaan in welke volgorde je de zuiveringsstappen gaat
uitvoeren.
Wel richtlijnen voor de stappen (hiernaast)
Hoe minder wijzigingen in de buffer soort, hoe
gunstiger voor je zuiveringsproces
Na elke zuiveringsstap wordt het gescheiden materiaal verzameld in
fracties. Deze worden mbv een essay getest voor aanwezigheid van eiwit
van interesse
De specifieke activiteit is de enzymactiviteit gecorrigeerd voor totale
hoeveelheid eiwit. Dus eiwitconcentratie en volume moeten bekend zijn
Formules worden niet gegeven op tentamen
Verschillende technieken om eerst monstervolume te
verkleinen
Kan mbv uitzouten door ammonium sulfaat precipitatie →
eiwitten niet permanent gedenatureerd
Gewenste eiwit laten neerslaan en met het pellet verder
werken.
Hoewel ammonium sulfaat precipitatie de meest gebruikte
differentiële precipitatie techniek is, zijn er meerdere
methoden. Door de pH of temperatuur te veranderen of door
te werken met organische oplosmiddelen of polymeren zoals
PEG kan ook precipitatie veroorzaakt worden.
, Kolomchromatografie berust op het feit dat
verschillende moleculen verschillend hechten aan de
stationaire fase, de kolom. Hierdoor gaat het ene
molecuul sneller door de kolom dan de andere →
eluentietijd verschilt
Daarmee scheiding op basis van affiniteit en
hydrofobiciteit
Kolom kan gevarieerd worden in lengte en diameter →
hoe hoger, hoe betere resolutie
Mobiele fase is een vloeistof.
Procedure kan passief plaatsvinden, maar vaak gebruik
gemaakt van hoge druk waardoor mobiele fase langs
stationaire fase wordt geleid
Stationaire fase bestaat hierbij uit poreuze beads.
Grootte van de beads en poriën kunnen variëren.
Kleine moleculen komen er wel door en grotere niet,
waardoor scheiding op basis van grootte
Stationaire fase is hierbij een packing van beads met
geïoniseerde groepen aan het oppervlak. Er bestaan
twee typen een kationenwisselaar (S-type) of
anionenwisselaar (Q-type). Een kationenwisselaar
bestaat zelf uit negatief geladen groepen, een
anionenwisselaar bestaat zelf uit positief geladen
groepen. Het idee is dan dat de eiwitten van interesse
sterk binden en andere componenten snel elueren.
pH is essentieel, want eiwitten hebben eigen IEP. Eiwit
met hoog pl zal bij neutrale pH positief geladen zijn en
sterk binden aan kationenwisselaar. Eiwitten met een
laag pl elueren dan juist snel. Door zoutconcentratie
geleidelijk te verhogen zullen eiwitten gescheiden
worden op basis van pl-waarde.
Door aan het einde een was te doen van een hoog
zoutgehalte zullend de meest sterke componenten ook
van de kolom komen
Life Sciences – Hogeschool Utrecht
Semester 6
Biochemische technieken
Introductie Biotechniques Part I
A = precursor
D = eindproduct
B & C = intermediaire metabolieten
Tussenproducten kunnen ook
geanalyseerd worden om wat te zeggen
over eindproduct. Ook andere receptoren
of signaalstoffen die bij de pathway horen
Je wilt uiteindelijk eindigen met een fractie van
zoveel mogelijk eiwit van interesse wilt zonder
verontreinigingen
Eindproduct analyseren m.b.v. ELISA, SDS en
Western Blot etc. maar ook tussenproducten al
analyseren
Toename van zuiverheid gaat wel ten kosten
van totale opbrengst, de yield. Je verliest
namelijk bij elke stap materiaal
Weefselhomogenisatie, cel lysis en fractionering
Het type methode van preparatie hangt af van welk soort materiaal
je mee begint.
Celsuspensies uit een celkweek kunnen op een zachte manier
behandeld worden. Stukjes weefsel kunnen harder behandeld
worden om te homogeniseren.
Osmotische shock = cellen eerst in hypertone oplossing. Dan
hypotone oplossing waardoor celwanden knappen
Vries-dooi cyclus = door temp. verschil kunnen ijskristallen
ontstaan waardoor celwand kapot
Mechanische methoden veroorzaken allemaal warmte waardoor
eiwitten denatureren
, Sonicators zorgen via een
metalen probe voor ultrasone
golven die cellen kapot maken.
Een ultrasoon waterbad zorgt
voor een iets zachtere
methode van celdisruptie
Homogenisers zorgen ervoor dat cellen tegen de
glaswand gedrukt worden waardoor ze kapot
gaan. Is minder krachtig dan een blender of
rotor-stator
Gebruikt wanneer intacte organellen nodig zijn
Als een enzym vrijkomt wordt het blootgesteld aan
allerlei factoren die voor denaturatie kunnen zorgen.
Daarom buffers gebruiken met reagentia die mogelijke
schadelijke effecten te niet doen. Daarnaast voorkomen
om op ijs of in koude omgeving te werken, anders ook
verlies van activiteit
Lijst van componenten die aanwezig kunnen zijn in
homogenisatiebuffer. Maar ook componenten die
later tijdens eiwitzuiveringsstappen belangrijk zijn in
oplossingen staan hier genoemd.
Buffer dient als vervanging voor het intracellulaire
buffersysteem dat nu niet meer aanwezig is
Wel weten welke stofjes waar voor zijn
Bij cellysis komen ook proteasen vrij die normaal
verpakt zitten in lysosomen.
Daarom gebruik van protease inhibitors
, Lysis technieken worden ook vaak
gecombineerd voor optimaal resultaat
In deze fase is het belangrijk om een maximale
opbrengst van intact eiwit na te streven
Vaak eerst centrifugeren en pellet en supernatant
scheiden. Kan ook in stapsgewijze methode waarbij
grote organellen van kleine eiwitten worden
gescheiden in meerdere stappen
Bij stapsgewijs isoleren ga je supernatant bij steeds
hogere snelheid centrifugeren. Opnieuw scheiden en
opnieuw centrifugeren enz.
Tot de fractie waar gewenste eiwit/organel in zit
Andere manier om organellen of andere
componenten te scheiden
Verschillende concentraties sucrose; de deeltjes
komen in de fractie terecht waar de dichtheid
overeenkomt met de dichtheid van het medium
Kunnen tot 50.000 rpm met krachten van
100.000 g. Soms ook dagenlang afdraaien voor
hele kleine organellen of macromoleculen
, Rechts is geschikt voor gradiënt methode. Dat
kan niet met de linker, want dan zakken de
verschillende gradiënt in door resuspensie.
Verschillen in buizen moeten minder dan 0,1
gram zijn. Rotors mogen geen haarscheuren
hebben, dienen juist te worden verwisseld
schoongemaakt en bewaard worden.
Na centrifugeren wil je zoveel mogelijk niet-
eiwit componenten kwijtraken. Kan met behulp
van detergentia (voor membranen en lipiden) of
met DNAses en RNAses (voor nucleïnezuren)
Soms noodzakelijk om zouten te verwijderen of buffers aan te
passen. Te zuiveren sample dan in een semipermeabele zak
doen en in bekerglas met gewenste buffer hangen.
Dan bepaalde cut-off waarde; tot een bepaalde grootte kunnen
moleculen en eiwitten wel door de membraan heen.
Filtratiemethode waarbij druk- of centrifugegradiënten leiden
tot een scheiding door een semipermeabel membraan.
Retentaat: komt niet door het membraan heen
Permeaat (filtraat): komt wel door het membraan heen
Op die manier scheiding en ook concentratie van het sample
, Voordat je begint aan de zuivering moet je eerst een
zuiveringsstrategie hebben
Eiwitzuivering - Uitzoeken wat er bekend is over te isoleren eiwit
- Wat zijn de fysische en biologische eigenschappen
- Moleculaire massa en het iso-elektrisch punt bepalen
voor als je ion-exchange chromatografie wilt doen
- Hoe hydrofoob is het eiwit?
- Eventuele reactieve groepen van het molecuul/eiwit
- …
Nagaan in welke volgorde je de zuiveringsstappen gaat
uitvoeren.
Wel richtlijnen voor de stappen (hiernaast)
Hoe minder wijzigingen in de buffer soort, hoe
gunstiger voor je zuiveringsproces
Na elke zuiveringsstap wordt het gescheiden materiaal verzameld in
fracties. Deze worden mbv een essay getest voor aanwezigheid van eiwit
van interesse
De specifieke activiteit is de enzymactiviteit gecorrigeerd voor totale
hoeveelheid eiwit. Dus eiwitconcentratie en volume moeten bekend zijn
Formules worden niet gegeven op tentamen
Verschillende technieken om eerst monstervolume te
verkleinen
Kan mbv uitzouten door ammonium sulfaat precipitatie →
eiwitten niet permanent gedenatureerd
Gewenste eiwit laten neerslaan en met het pellet verder
werken.
Hoewel ammonium sulfaat precipitatie de meest gebruikte
differentiële precipitatie techniek is, zijn er meerdere
methoden. Door de pH of temperatuur te veranderen of door
te werken met organische oplosmiddelen of polymeren zoals
PEG kan ook precipitatie veroorzaakt worden.
, Kolomchromatografie berust op het feit dat
verschillende moleculen verschillend hechten aan de
stationaire fase, de kolom. Hierdoor gaat het ene
molecuul sneller door de kolom dan de andere →
eluentietijd verschilt
Daarmee scheiding op basis van affiniteit en
hydrofobiciteit
Kolom kan gevarieerd worden in lengte en diameter →
hoe hoger, hoe betere resolutie
Mobiele fase is een vloeistof.
Procedure kan passief plaatsvinden, maar vaak gebruik
gemaakt van hoge druk waardoor mobiele fase langs
stationaire fase wordt geleid
Stationaire fase bestaat hierbij uit poreuze beads.
Grootte van de beads en poriën kunnen variëren.
Kleine moleculen komen er wel door en grotere niet,
waardoor scheiding op basis van grootte
Stationaire fase is hierbij een packing van beads met
geïoniseerde groepen aan het oppervlak. Er bestaan
twee typen een kationenwisselaar (S-type) of
anionenwisselaar (Q-type). Een kationenwisselaar
bestaat zelf uit negatief geladen groepen, een
anionenwisselaar bestaat zelf uit positief geladen
groepen. Het idee is dan dat de eiwitten van interesse
sterk binden en andere componenten snel elueren.
pH is essentieel, want eiwitten hebben eigen IEP. Eiwit
met hoog pl zal bij neutrale pH positief geladen zijn en
sterk binden aan kationenwisselaar. Eiwitten met een
laag pl elueren dan juist snel. Door zoutconcentratie
geleidelijk te verhogen zullen eiwitten gescheiden
worden op basis van pl-waarde.
Door aan het einde een was te doen van een hoog
zoutgehalte zullend de meest sterke componenten ook
van de kolom komen
