Hoofdstuk 19 DNA-technologie
§1: DNA-sequencing en klonen
Bij DNA-technologie wordt er vaak met DNA gewerkt waarbij het wordt gemanipuleerd. Deze technieken zijn mogelijk
doordat we weten dat de twee strengen van DNA complementair zijn aan elkaar.
Bij DNA-technologie is de sleutel tot de technieken nucleïnezuurhybridisatie. Dit is de basenparing van een streng van een
nucleïnezuur aan een complementaire sequentie van een andere nucleïnezuurstreng. Deze andere streng kan ofwel DNA
zijn of RNA, maar is dus wel complementair.
Nucleïnezuurhybridisatie vormt de basis voor vrijwel elke techniek die wordt gebruikt bij genetische manipulatie. Genetisch
manipuleren houdt het manipuleren van genen voor praktische doeleinden in.
Het is mogelijk om de complementaire basenparing uit te voeren, doordat de volledige nucleotidesequentie van een DNA-
molecuul te weten te komen. Dit kan door DNA-sequencing. DNA-sequencing kan op de oude manier; Sanger-sequencing
of om de nieuwe generatie sequencing manier.
Deze twee vormen hoeven we niet in detail te weten, maar wel m.b.v. van gegeven voorbeelden en theorie op de toets
kunnen toets. In het kort Sanger-sequencing en nieuwe generatie sequencing:
> Bij Sanger-sequencing gaat er per stikstofbasen (A, C, G en T) het DNA-molecuul af, waarbij telkens wanneer deze erin
voorkomt de keten stopt. Uiteindelijk heb je dus van de stikstofbasen alle plaatsen op het molecuul. Wanneer je dit van alle
4 de basen gedaan hebt, heb je het complete molecuul en kun je hem zo herschrijven.
> Bij de nieuwe generatie sequencing wordt er een elektrisch signaaltje gegeven elke keer wanneer er een specifiek basen
in de keten voorkomt. Door dit bij elke basen te doen, kom je erachter wat de samenstelling is. Deze signaaltjes worden op
een grafiek weergegeven en in deze grafiek zie je welke basen in welke volgorde voorkomt en hoe hoger de piek, hoe vaker
deze voorkomt achter elkaar.
Voor veel technieken is maar een klein deel van een groot DNA-molecuul nodig. Nu zijn er methoden om dit deel te isoleren
en veel identieke kopieën van dit stuk te maken. Dit het DNA-klonering. Zo krijgen ze dus een aantal kopieën van het DNA-
segment die ze willen hebben. Er is een techniek om DNA te klonen m.b.v. bacteriën, hierbij worden de plasmiden van
bacteriën gebruikt om te klonen. Plasmide zijn klein circulaire DNA-moleculen die afzonderlijk worden gerepliceerd. Deze
plasmiden worden bij deze manier van DNA-klonering geïsoleerd, waarna het stukje DNA dat onderzocht gaat worden in de
plasmiden wordt geplaatst. Deze plasmiden is nu een recombinant-DNA-molecuul; het bevat DNA van twee verschillende
bronnen. Het plasmide wordt teruggebracht naar de bacteriële cel, die door celdelingen een kloon v/d cel begint te
vormen. Bij deze vorm worden naast de plasmiden die ze willen hebben, ook alle genen en het DNA v/d bacteriecel ook
gekloond. Het plasmide fungeert in dit geval als kloneringsvector. Dit is een DNA-molecuul dat vreemd DNA in een
gastheercel kan dragen en daar kan repliceren.
De productie van meerdere kopieën van een enkel gen is een soort DNA klonen dat genklonering wordt genoemd.
Bij het klonen van genen en genetische manipulatie zijn we over het algemeen afhankelijk van het gebruik van enzymen die
DNA-moleculen op een beperkt aantal specifieke locaties knippen. Deze enzymen worden restrictie-enzymen genoemd.
Restrictie-enzymen beschermen de bacteriecel door vreemd DNA van andere organismen te knippen.
Elk restrictie-enzym is zeer specifiek en herkend een bepaalde korte restrictie plaats. Deze enzymen beschermen de cel
door de toevoeging van methylgroepen aan de groepen die door enzymen worden herkend. De meeste restrictie-enzymen
herkennen sequenties die 4 tot 8 paren bevat. Omdat elke sequentie die zo kort is meestal vaak voorkomt in een lang DNA-
molecuul, zal een restrictie-enzym veel sneden maken in zo’n DNA-molecuul. Dit levert een
reeks restrictiefragmenten op.
Bepaalde restrictie-enzymen splitsen de DNA-strengen op een verspringende manier,
waardoor je bij de strengen een stukje hebt, wat nog basen bevat van 1 streng, maar de complementaire paren zijn dan
weg gesplitst hiervan (zie de afbeelding). Dit stukje dat dus geen paren meer bevat, noem je het kleverige uiteinde/ sticky
end.
Om de recombinante plasmiden te controleren na alle gemaakte kopieën, kan een onderzoeker de producten opnieuw
knippen met hetzelfde enzym. Als het insert aanwezig is, zouden er twee DNA-fragmenten zijn, één ter grootte van de
oorspronkelijke plasmide en één ter grootte van het ingevoegde DNA.
Om fragmenten te scheiden en te visualiseren, kunnen ze gelelektroforese uitvoeren. Hierbij gebruiken ze een gel die
is gemaakt van een polymeer met kleine gaatjes van verschillende groottes. Hierdoor kunnen kortere fragmenten
sneller reizen en komen die verder. Het werkt als een soort zeefje. Hierbij worden de fragmenten dus op basis
van lengte gescheiden. DNA is negatief geladen, waardoor ze naar het positieve eind toe willen
reizen, de kortere segmenten doen dit dus sneller.
Bij PCR; polymerasekettingsreactie wordt het DNA volledig en exact gekopieerd. Er zijn
verschillende doeleinden voor de PCR; Dit gekopieerde DNA kunnen ze vervolgens bijv. invoegen bij
een plasmiden om zo een recombinante cel te krijgen.
, PCR bestaat uit een cyclus van 3 stappen:
1. Eerst wordt het DNA gedenatureerd (gescheiden), hierbij wordt het reactiemengsel tot
een hoge temperatuur gebracht.
2. Daarna laten ze het afkoelen om waterstofbinding van korte, enkelstrengs DNA-primers
mogelijk te maken die complementair zijn aan de sequenties op tegenoverliggende
strengen op elk uiteinde van de doelsequentie, deze fase van het binden van de primers
wordt annealing genoemd.
3. Hierbij verlengt een speciaal soort DNA-polymerase de primers in de 5’ -> 3’-richting.
Deze cyclus wordt vervolgens 30 tot 40 keer gehaald. Voor PCR wordt er gebruik gemaakt
van een hittebestendig DNA-polymerase-enzym genaamd Taq-polymerase. Voorheen werd
de normale DNA-polymerase ook gedenatureerd en zou deze na elke cyclus vervangen
moeten worden.
PCR kan het klonen van DNA m.b.v. plasmiden niet vervangen, omdat het in grote
hoeveelheden lang niet zo efficiënt en goed verloopt. In plaats daarvan, wordt het gebruikt
voor specifieke DNA-fragmenten. PCR-primers worden gemaakt om aan elk uiteinde van het
gewilde fragment een restrictieplaats te omvatten, zodat dit fragment samen met de vector
wordt geknipt. De resulterende plasmiden worden gesequenced, zodat die met foutloze
insert kunnen worden geselecteerd.
Het gekloonde stukje die door de PCR-methoden is ontstaan is dus het stukje ingevoegde
DNA die wordt toegevoegd aan het plasmide (zie hiernaast).
Vervolgens moet het recombinante DNA in de eukaryote cellen worden ingebracht. Dit kan m.b.v. elektroporatie. Hierbij
creëren ze een korte elektrische puls die wordt toegepast op een oplossing die cellen bevat, waardoor er tijdelijk gaten in
hun plasmamembranen komen. Hierdoor kan het DNA binnen dringen.
Ook kunnen wetenschappers DNA in enkele eukaryote cellen injecteren m.b.v. microscopisch dunne naalden.
§2: Het bestuderen van genexpressie
Door te kijken naar waar genen of een groep genen tot expressie wordt gebracht, kun je belangrijke aanwijzingen krijgen
over hun functie en hoe ze bijdragen aan het organisme als geheel. Deze locatie kun je achterhalen door naar de mRNA te
kijken die bij deze genexpressie betrokken is.
Voor deze mRNA streng wil je een complementaire streng krijgen. Dit krijg je d.m.v.
nucleïnezuurhybridisatie met de complementaire mRNA moleculen.
Door een gekloond gen als sjabloon te gebruiken, kunnen ze een kort, enkelstrengs nucleïnezuur (RNA of
DNA) synthetiseren dat complementair is aan het mRNA-molecuul die van belang was bij die expressie die
ze wouden onderzoeken. Dit wordt een nucleïnezuurprobe genoemd.
Als voorbeeld een deel van de sequentie op het mRNA: 5’ - C U C A U C A C C G G C – 3’
Dan zouden ze deze enkelstrengs DNA-probe maken: 3’ - G A G T A G T G G C G C – 5’
Elk probemolecuul wordt tijdens de synthese gelabeld met een fluorescerend label zodat hij te volgen is.
Vervolgens wordt deze complementaire streng ingebracht in de onderzochte cel, waarbij ze de dus in het
intacte organisme het mRNA kunnen volgen. Dit wordt situ hybridisatie genoemd.
Er zijn ook nog andere manieren om mRNA te kunnen detecteren,
een voorbeeld hiervan is de reverse transcriptase-polymerase
kettingreactie, oftewel de RT-PCR. Deze begint met het omzetten
van mRNA in dubbelstrengs DNA-moleculen met overeenkomstige
sequenties.
Eerst wordt het enzym reverse transcriptase gebruikt om een complementaire DNA-
kopie te maken van elk mRNA in het monster.
Het mRNA wordt vervolgens afgebroken door een enzym,
waarna een tweede DNA-streng (complementair aan de eerste)
wordt gemaakt door DNA-polymerase. Dit wordt het
complementaire DNA (cDNA) genoemd. Doordat deze via
mRNA is gemaakt, mist cDNA introns. De volgende stap van RT-
PCR is de PCR-methode, zo krijg je een aantal kopieën van de
DNA-strengen.
Vervolgens gaan ze kijken welke genen tot expressie worden
gebracht door eenvoudig de cDNA-monsters te sequencen.
Deze ongecompliceerde methode wordt RNA-sequencing genoemd, ookal sequence je dus het cDNA.
Hierbij worden de mRNA monsters geïsoleerd, in kortere fragmenten van vergelijkbare grootte
gesneden en omgezet in cDNA’s. Van deze korte cDNA stukken wordt de sequentie bepaald en een
computerprogramma brengt vervolgens het genoom van de betreffende soort in kaart.
Een oudere methode voor genoom brede expressiestudies is DNA-microarray-assays. Deze is minder
