Samenvatting

Samenvatting Real-Time-PCR

0 keer verkocht

Vak
Real-Time PCR

Instelling
Avans Hogeschool (Avans)

Gehouden presentaties en extra aantekeningen gedurende de lessen en van eerdere vakken ter aanvulling. Deze aantekeningen zijn passend bij het theoretische deel van het vak Real-time-PCR dat gegeven wordt in BMO leerjaar 3 gedurende de specialisatie Patient gericht onderzoek

[Meer zien]

Voorbeeld 4 van de 57 pagina's

Bekijk voorbeeld

Geupload op 29 maart 2023
Aantal pagina's 57
Geschreven in 2022/2023
Type Samenvatting

pcr
realtime
end point
tagman
hybride
probes
fluoriscentie
scorpion
beacon
moleculair
dna
smeltcurve

Volgen

cheyennevankraaij Lid sinds 4 jaar 22 documenten verkocht

€7,41

In winkelwagen

Opslaan

100% tevredenheidsgarantie
Direct beschikbaar na je betaling
Lees online óf als PDF
Geen vaste maandelijkse kosten

Real-Time
PCR
BMO, P 3.1

Cheyenne van Kraaij

,Inhoud
Les 1a - Real time PCR ............................................................................................................................. 2
1.1 Difference between real-time PCR and end point PCR ................................................................. 2
1.2 Real-Time PCR principle ................................................................................................................ 2
1.3 Controls and aspecific amplification: PC/NTC/No-RT/IC, melting curves ..................................... 5
1.4 Quantification methods ................................................................................................................ 9
1.5 Detection: probes and fluorescent dyes ..................................................................................... 11
1.6 Mutation detection en overig ..................................................................................................... 20
Les 1b – Real-Time PCR ......................................................................................................................... 21
Les 2 – Real-Time-PCR ........................................................................................................................... 24
2.1 Analysis of PCR products ............................................................................................................. 24
2.2 Real-time PCR guidelines and terminology ................................................................................. 27
2.3 Real-time PCR quantification....................................................................................................... 30
Les 3 – Real-Time PCR ........................................................................................................................... 34
3.1 How to get control over the specificity of your PCR? ................................................................. 34
3.2 Getting control over your PCRs: What is PCR contamination? ................................................... 37
3.3 Two new controls in molecular diagnostics: no-RT and inhibition control ................................. 40
3.4 Aanvulling .................................................................................................................................... 46
Les 4 – Real-Time PCR ........................................................................................................................... 48
4.1 Interpretation of data from real-time PCR .................................................................................. 48
4.2 Some final pieces of theory ......................................................................................................... 50
Voorbereidende vragen ........................................................................................................................ 53

1

,Les 1a - Real time PCR
❖ Difference between real-time PCR and end point PCR
❖ Principle of real-time PCR
❖ Controls and aspecific amplification: PC/NTC/No-RT/IC, melting curves
❖ Quantification methods
❖ Detection: probes and fluorescent dyes
❖ Mutation detection

1.1 Difference between real-time PCR and end point PCR
Moleculaire diagnostiek: hoofdstukken 5 en 7

End point PCR or conventional PCR;
• PCR is stopped at a convenient cycle number to perform next steps e.g., gel electrophoresis or
sequencing

But what is the difference with real-time PCR?
• You can follow the PCR throughout all cycles using fluorescence measurements and you don’t
have to do the next steps required for end point PCR.
• Nowadays many diagnostic methods are based on real-time PCR

During real time PCR you can follow the DNA synthesis process on a PC
• When DNA synthesis is above background
• When exponential multiplication occurs
• When DNA synthesis ends on a plateau

1.2 Real-Time PCR principle

continuous monitoring of PCR product accumulation i.e. measure every cycle the amount of
fluorescence

relationship between the time fluorescence increases above background and the initial amount of
template i.e. the sooner fluorescence is visible, the more template was present, and vice versa

Bij realtime PCR wordt de toename van amplimeren die in opeenvolgende cycli worden
gesynthetiseerd afgelezen aan de stijging van een fluorescentie signal. Tijdens iedere cyclus wordt de
toenemende hoeveelheid fluorescentie gemeten. De meting vindt plaats aan het einde van de
annealingsfase (dual probes en molecular beacons) of wanneer de elongatiefase gereed is
(intercalerende kleurstoffen zoals SYBR Green, hydrolyse probes) (paragraaf 5.5)

R, Rn, ΔRn

R: fluorescence obtained without any normalization (raw data)
Rn: Normalized reporter signal = emission intensity of the reporter dye
emission intensity of the passive reference dye (ROX)
ΔRn = Rn – background (No Template Control; NTC)

2

, Rox: reduction of technical variation
ROX (carboxy-X-rhodamine) is used as a passive reference dye in ROX-dependent real-time PCR
systems to normalize for differences in fluorescence levels that can occur due mainly to optical path
variations among wells. ROX is not involved in the PCR reaction, and ROX fluorescence levels have no
relationship to the quantity of DNA in each well, so the addition of this fluorophore to a supermix
provides a constant fluorescent signal during the amplification cycles. The constancy of ROX
fluorescence relative to reporter fluorescence signal is used for well-to-well fluorescence
normalization.

Different types of real-time PCR systems that require a passive reference standard have different
optimal concentrations of ROX, mainly due to the different optical configurations of each system,
particularly the type of excitation source and optics used. For some PCR master mixes, the user must
determine the correct ROX concentration to optimize real-time PCR results; however, using Bio-Rad
universal real-time PCR supermixes, there is no guesswork — our universal reagents can be used on
any real-time PCR system.

To normalize real-time PCR data, the fluorescence emission intensity of the reporter dye (for
example, SYBR®Green) is divided by the fluorescence emission intensity of the ROX passive reference
dye. This ratio is the normalized reporter intensity, or Rn.

Amplification Plot and quantification Cycle, Cq.

Bij realtime PCR wordt de toename van amplimeren die in opeenvolgende cycli worden
gesynthetiseerd afgelezen aan de stijging van een fluorescentie signal. Tijdens iedere cyclus wordt de
toenemende hoeveelheid fluorescentie gemeten. De meting vindt plaats aan het einde van de
annealingsfase (dual probes en molecular beacons) of wanneer de elongatiefase gereed is
(intercalerende kleurstoffen zoals SYBR Green, hydrolyse probes)

3

Dit zijn jouw voordelen als je samenvattingen koopt bij Stuvia:

Bewezen kwaliteit door reviews

Studenten hebben al meer dan 850.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet jij zeker dat je de beste keuze maakt!

In een paar klikken geregeld

Geen gedoe — betaal gewoon eenmalig met iDeal, creditcard of je Stuvia-tegoed en je bent klaar. Geen abonnement nodig.

Direct to-the-point

Studenten maken samenvattingen voor studenten. Dat betekent: actuele inhoud waar jij écht wat aan hebt. Geen overbodige details!

Veelgestelde vragen

Wat krijg ik als ik dit document koop?

Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.

Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?

Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.

Van wie koop ik deze samenvatting?

Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper cheyennevankraaij. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.

Zit ik meteen vast aan een abonnement?

Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €7,41. Je zit daarna nergens aan vast.

Is Stuvia te vertrouwen?

4,6 sterren op Google & Trustpilot (+1000 reviews)

Afgelopen 30 dagen zijn er 66184 samenvattingen verkocht

Opgericht in 2010, al 15 jaar dé plek om samenvattingen te kopen

Begin nu gratis

Samenvatting

Samenvatting Real-Time-PCR

Document informatie

Onderwerpen

Geschreven voor

Verkoper

Ontvangen beoordelingen

Voorbeeld van de inhoud