Werkcolleges
van Genoom tot Populatie
WERKCOLLEGE 1 DNA REPLICATIE, TRANSLATIE EN SPLICING
Opdracht 1
In de notatie van strengen DNA of RNA worden vaak de afkortingen A, G, C, T en U gebruikt, die staan voor
respectievelijk adenine, guanine, cytosine, thymine en uracil of voor adenosine, guanosine, cytidine, thymidine
en uridine.
- Wat is formeel het verschil tussen beide rijtjes?
Nucleotide is het hele molecuul wat samen als je het achter elkaar koppelt DNA of RNA vormt. Nucleotide heeft
zowel base, als suiker (ribose of deoxyribose) en fosfaat.
Adenine, guanine, cytosine, thymine en uracil zijn formeel de namen van de base zelf
Adenosine, guanosine, cytidine, thymidine en uridine zijn de basen gekoppeld aan ribose = nucleoside.
Base + suiker = nucleoside
Base + suiker + fosfaat = nucleotide
Base moet gekoppeld zijn aan suiker en fosfaat voordat je er een polymeer van kan maken.
Belangrijkste is dat base altijd vast zit aan ribose en via fosfaat aan volgende ribose.
- Zal ATP dus staan voor adenosinetrifosfaat of voor adeninetrifosfaat?
AMP = adenosine monofosfaat, dAMP = deoxyadenosine monofosfaat, UDP = uridine difosfaat, ATP =
adenosine trifosfaat.
Adenosine zit vast aan 5’ met 3 fosfaten dus formeel heet het adenosine trifosfaat.
Verschil tussen dAMP en AMP: het soort suiker (deoxyribose of ribose). Blauwe is ribose, is een 5’ suiker dus
ribose. Hoe kan je zien of het deoxy is of ribose. Deoxy betekent geen zuurstof, ergens mist hij een zuurstof.
Hoeveel OH’s heeft een suiker? Een suiker is een koolhydraat, aan elke C zit een OH. Hij heeft 5C’s maar C2
maakt verschil.
C2 is ook enige plek zonder functie. C1 is OH gevangen door stikstof van base, zit altijd stikstof (zowel bij DNA
als RNA dus geen verschil). 3’ OH bind met 5’ P en aan 5’ zit altijd P. Dus is ook zelfde in DNA en RNA. Alleen
C2 kan verschil maken. Op 2’ zit verschil tussen deoxy base en gewone base. Heeft herkenningsfunctie, verder
geen functie
ATP staat voor adenosine trifosfaat want is een nucleoside met daaraan 3 fosfaten.
Belangrijkste uit deze vraag: weten hoe nucleotide opgebouwd wordt.
- Welke vier nucleotiden worden bij de replicatie gebruikt door DNA polymerase? (geef de officiële naam en de
afkorting)? Zijn andere nucleotiden helemaal niet betrokken bij de replicatie?
Adenine, cytosine, guanine en thymine zijn de basen. Hebben trifosfaatgroep voor energie, zijn gekoppeld aan
suiker. Als je DNA wil maken heet het deoxyadenosine, je moet deoxy gebruiken. Deoxynucleotiden gebruikt
hij voor replicatie.
Deoxy-cytidine trifosfaat (dCTP), deoxy-thymidine trifosfaat (dTTP), deoxy-adenosine trifosfaat (dATP), deoxy-
guanosine trifosfaat (dGTP)
Je zegt dus: nucleoside met daarin een deoxysuikergroep, gebonden aan 3 fosfaat.
Je hebt bijvoorbeeld dCTP. Op 2’ zit geen OH maar een H (want deoxy), op de keten zit vrije OH aan 3’ eind,
en je hebt de trifosfaat. Bind aan de fosfaat en pyrofosfaat valt eraf, wordt 2 Pi. Je hebt dan nieuwe
deoxynucleotiden aan de keten. G bepaalt dat er een C inkomt maar moet deoxy zijn anders kan hij hem niet
verlengen. Vormen fosfodiesterbindingen
Adere nucleotiden zijn wel betrokken. Voor RNA heb je gewone nucleotiden nodig en dus voor de primer die uit
RNA ontstaat ook
Is dit ATP die je maakt aan ATP synthase in ademhalingsketen? ATP die je gebruikt voor energie is precies
zelfde energie die je gebruikt om RNA synthese te doen. Dient in kern voor synthese van RNA, buiten de kern
,of op andere plek gewoon energiebron. Zelfde geldt voor GTP en UTP, ook op andere plekken nodig. Je kent ze
dus al maar uit hele andere context.
Voor DNA synthese:
Deoxy-adenosine trifosfaat (dATP)
Deoxy-guanosine trifosfaat (dGT)
Deoxy-cytidine trifosfaat (dCTP)
(Deoxy)thymidine trifosfaat ((d)TTP): omdat het alleen in DNA voorkomt wordt deoxy ook
weleens weggelaten want er bestaat geen gewone
Bij de replicatie wordt het RNA beginnetje van de strengen gemaakt door primase met de
nucleotiden:
Adenosine trifosfaat (ATP)
Guanosine trifosfaat (GTP)
Cytidinetrifosfaat (CTP)
Uridine trifosfaat (UTP)
Opdracht 2
De base 5-bromouracil (5BU) is een chemisch mutageen. Hij dankt zijn mutageniciteit aan zijn eigenschap dat
hij twee verschillende structuren kan aannemen, die spontaan in elkaar kunnen overgaan. In zijn ene,
normale, vorm gedraagt 5BU zich als uracil en zal dus met adenine een paar vormen, maar in zijn andere,
bijzondere, structuur gedraagt het zich als een cytosine en zal dus met guanine een paar vormen (zie Russell,
de
Fig. 11, p. 181; oude 3 ed. Fig. 7.11, p. 141).
a. Laat zien dat 5-Bromouracil zowel AT→GC als GC→AT mutaties (transities) kan veroorzaken door een
aantal replicatie cycli van een DNA sequentie te tekenen waarin 5BU is ingebouwd.
5-Bromouracil kan je toevoegen aan een cel, wordt ingebouwd in nucleotiden en verpest dan veel. Wat
bedoelen we met AT wordt GC? AT basepaar wordt vervangen door GC basepaar. A wordt een G, dan
automatisch wordt de T die er tegenover zit een C. Dus is niet zo dat A naar beide kan.
Van GC > AT, G wordt A en automatisch wordt C er tegenover naar T.
Kan het ook zijn dat bij AT > GC T naar C gaat? Kan ook, wie als eerste gegaan is weet je niet, we maken du
eigenlijk geen onderscheid. Transitie: je gaat niet van pyrimidine naar purine maar van een purine A naar
purine G en van thymidine T naar thymidine C dus is transitie. Van A naar C zou transversie zijn.
5BU is een base die 2 conformaties heeft:
1. Gedraagt zich als T en paart met A (lijkt dan op thymine, heeft alleen broom ipv methyl op 5’)
▪ Door deze wordt andere groep instabiel en kan flipfloppen. Je krijgt een andere conformatie.
2. Gedraagt zich als C en paart met G (OH gedraagt zich als aminogroep van cytosine, verder lijkt hij erop
(wel ook weer broom))
Hoe kan je door zon base die gelukkig niet voorkomt in natuur zulke mutaties krijgen? Voordat het kan
muteren moet het eerst veranderen.
TA > CG mutatie. Je hebt TA in DNA. Bij replicatie ga je strengen uit elkaar halen. Je hebt dan T en A, stel hij
is in vorm die op T lijkt kan hij paren aan de A. De T krijgt een normale A. Je hebt dus 1 streng met 5-
bromouracil erin en de andere niet. Op dit moment is er niks aan de hand want hij lijkt op een T, is een T als
hij zich zo blijft gedragen en bij volgende ronde is er dan niks aan de hand want wordt A aan gepaard.
Wanneer wordt het wel gevaarlijk? Stel je gaat nog een keer repliceren, kan hij nu gevaarlijk zijn. Zit in de
keten. Keten splitst in 5BU (die zich gedraagde als T) en A. Als 5BU die zich gedroeg als T zich nu gaat
gedragen als een C wordt er een G aan gekoppeld. Komt omdat hij niet meer in toom wordt gehouden door de
A en van conformatie kan veranderen. Dan is het al mis want ipv A heb je G. Als je volgende keer weer uit
elkaar gaat komt tegenover G normale C gezet.
,CG > AT mutatie
Precies omgekeerd! Inbouwen in C vorm, bedenken bij T vorm en A komt erin
Soms zijn mutaties random maar vaak hebben ze bepaald mechanisme.
b. Welke van de volgende mutaties in een eiwitketen kunnen veroorzaakt zijn door 1 enkele wijziging in het
DNA door het mutageen 5-bromouracil (genetische code staat aan het eind van dit werkcollege)?
Lys Glu
Asp Ala
Phe Leu
Hoe oplossen? Kijken naar genetische codes.
Lys > Glu kan wel
Lys AAA > Glu GAA kan veroorzaakt worden door 5 BU (AT > GC)
Lys AAG > Glu GAG kan veroorzaakt worden door 5 BU (AT > GC)
Derde positie is alleen verschillend; wobble. Laatste base is of purine (A, G) of alle nucleotiden.
A naar G kan, is hier gebeurt
Asp > Ala kan niet
Asp GAC > Ala GCC Puntmutatie, maar kan niet door 5 BU (geen transitie). A wordt C, maar dit is transversie.
> Ala GCA Geen puntmutatie
Asp GAT > Ala GCT Puntmutatie, maar niet door 5 BU. A naar C, maar dit is transversie.
> Ala GCG Geen puntmutatie
Phe > Leu kan wel
Phe TTC > Leu TTA Puntmutatie, maar kan niet door 5BU
Leu TTG Puntmutatie, maar kan niet door 5 BU
Leu CTA Geen puntmutatie
Leu CTC Puntmutatie. Kan wel door 5 BU (TA > CG)
Leu CTG Geen puntmutatie
Phe TTT > Leu CTT Puntmutatie. Kan wel door 5 BU (TA > CG)
Leu TTA Puntmutatie, maar kan niet door 5 BU
Leu TTG Puntmutatie, maar kan niet door 5 BU
Genetische codetabel staat in RNA want daar wordt code omgezet in eiwit. Als T geschreven nu omdat mutatie
plaatsvindt in DNA. In tabel staat U, moet je omzetten naar T.
Opdracht 3
Voordat we met translatie beginnen, nog even het verschil tussen replicatie en transcriptie. Hieronder zie je
een opname van DNA dat bezig is met replicatie en van DNA dat getranscribeerd wordt. Geef aan welke figuur
replicatie voorstelt en welke transcriptie? Geef ook aan waar de volgende termen zich bevinden door ze aan
het begin van betreffende pijl(en) te zetten: RNA; Leading strand; Lagging strand ; Origin of replication;
Promoter; RNA polymerase; DNA polymerase; Okazaki fragmenten
, 2 DNA polymerase per vork, 4 per hele plaatje
Promotor is aparte sequentie, technisch gezien DNA
TATA box is onderdeel van de promotor. Niet elke promotor heeft TATA box
Pormotor is bindingsplaats voor RNA polymerase, kan TATA box in zitten. Geeft aan welke kant hij op moet.
Ene streng heet template strand, andere heet coderende strand. Coderende strand is gelijk aan RNA sequentie.
Als je RNA weet, weet je ook sequentie van coderende strand. Je weet dan ook waar gen begint en eindigt, zo
kan je handigst genen opsporen omdat je weet hoe RNA eruit ziet.
RNA polymerase verbreekt binding tussen DNA template en RNA waardoor de helix zich weer kan sluiten
3’ polyA staart en 5’ cap, van 5’ naar 3’ door ribosoom getrokken dus cap geeft begina aan.
Opdracht 4
Het aminozuur op plaats 102 in de sequentie van een bacterieel enzym is glycine, en het corresponderende
codon in de mRNA sequentie voor het enzym is GGA. Stel dat een mutatie die het codon verandert in GCA
geen invloed heeft op de activiteit van het enzym, maar dat een andere mutatie die het codon verandert in
UGA het enzym inactiveert. Verklaar deze waarnemingen en geef de algemene namen van de 2 verschillende
mutaties.
GGA = glycine
GCA = alanine
Verschil tussen de 2 is niet erg groot, H groep of CH3 groep. Ene is kleiner, andere iets groter maar lijken
sprekend op elkaar.
Glycine naar alanine mutatie, niet-synonieme mutatie en neutral mutatie volgens Russell
Blijkbaar heeft deze mutatie geen effect want zijketens glycine (-H) en alanine (-CH3) lijken op elkaar. G naar
C mutatie is transversie en niet-synoniem, neutral. Volgens Russel neutraal maar je mag ook niet-synonieme
noemen
UGA = stopcodon, is wel erg, nonsense mutatie. Heeft inactief eiwit tot gevolg. Blijkbaar heeft enzym intact C-
terminaal gedeelte nodig voor activiteit. G naar T mutatie is transversie en nonsense en loss of functie
Opdracht 5
Het is essentieel dat spliceozomen (snRNPs complexen) introns precies verwijderen, d.w.z. tussen het laatste
nucleotide van een intron en het eerste nucleotide van een exon. Om te zien waarom dat zo nauw luistert,
veronderstellen we bijvoorbeeld even dat de sequentie op de grens tussen een intron en een exon is
Veronderstel verder dat een spliceozoom af en toe het RNA transcript tussen de G en C residuen in het exon
splitst, met als gevolg dat de volgende twee moleculen ontstaan:
Wat zou de consequentie van deze splitsing zijn?
Reading frame verandert. Is belangrijk dat je precies goed spliced. Als je 1 base te ver zit ga je uit frame,
reading frame gaat weg. Je krijgt allemaal andere aminozuren en totaal ander eiwit. Foutive splicing
veroorzaakt verandering van leesframe = frame shift. Hierdoor zullen andere aminozuren worden ingebouwd
