Molecular Biology of the Cell (sixth edition) – Alberts – Deeltoets 1 (H5, H6, H4, H7 & H9)
Chapter 5 – DNA Replication, Repair and Recombination
Slechts zelden komt het voor dat DNA-onderhoudingsprocessen falen. Dit resulteert in een permanente
verandering van DNA = mutatie (mutation). Dit kan een organisme verwoesten als het op een vitale positie
gebeurt. De mutatiesnelheid (mutation rate) is de snelheid waarbij veranderingen ontstaan in het DNA zijn
extreem langzaam. E. coli wordt gebruikt om dit te bepalen, ze delen snel. Fractie beschadigde genen
onderschat de werkelijke mutatiesnelheid doordat veel mutaties “silent” zijn → bv. veranderen codon, maar niet
het aminozuur/veranderen aminozuur, maar niet het eiwit.
Cellen van seksueel reproducerend dier/plant zijn van twee typen: kiemcellen (germ cells) en somatische cellen
(somatic cells). Kiemcellen dragen genetische informatie over van ouder naar nakomeling. Somatische cellen
vormen het lichaam van het organisme. Kiemcellen moeten worden beschermd tegen hoge mutatiesnelheden
om de soort te behouden. Maar somatische cellen moeten ook worden beschermd voor behoud van
georganiseerde structuur.
Elk organisme dupliceert zijn DNA met buitengewone nauwkeurigheid voordat een cel zich deelt.
De helix wordt geopend en beide strengen dienen als template voor een nieuwe
streng. DNA polymerase zorgt voor nucleotide-polymerisatie. Vrije nucleotiden =
deoxyribonucleotide trifosfaten (dATP/dGTP/dCTP/dTTP).
Elke dochtercel krijgt een DNA dubbele helix met een
oude en een nieuwe streng = semiconservatief
Bij de replicatievork (replication fork) synthetiseert een
multi-enzymcomplex (bevat DNA-polymerase) DNA van
de twee dochterstrengen. Een DNA helix heeft twee antiparallele
strengen. Polymerisatie gaat van 3’ naar 5’ en een nieuwe
streng wordt gesynthetiseerd van 5’ naar 3’. Een streng
synthetiseert daarom Okazaki fragmenten (lagging strand)
De continue gesynthetiseerde streng heet de leading strand.
DNA polymerase voert de eerste proofreading stap uit
net voordat een nieuwe nucleotide wordt toegevoegd aan
de keten. De correcte nucleotide heeft een hogere affiniteit
voor de verplaatsende polymerase dan de incorrecte nucleotide,
omdat correcte paring meer energetisch gunstig is. Voor
covalente binding, ondergaat enzym conformationele verandering,
active site grip versterkt → deze verandering sneller met correcte
basenparing (“double-check” van polymerase)
Error-correcting reactie: exonucleolytic proofreading → vindt plaats wanneer een
incorrecte nucleotide covalent is gekoppeld aan een groeiende keten. DNA polymerase
heeft een (eerder gevormde) 3’-OH van een primer streng nodig om een keten te
kunnen verlengen. DNA polymerase bevat 3’-to-5’ proofreading exonuclease die
mis-gepaarde residu eraf haalt aan het primer uiteinde. DNA polymerase is dus self-correcting
RNA-polymerases (gentranscriptie) hoeven geen efficiënte exonucleotyisch
proofreading mechanisme, omdat fouten in RNA niet naar de volgende generatie
worden overgedragen. Daarnaast hebben RNA-polymerases ook geen primer nodig.
3’-5’ synthese kan niet, aan de 5’ kant zitten bij de inkomende vrije nucleotiden
de energierijke fosfaatbinding, die voor de koppeling zorgt. De 5’ kant van de streng zou dan voor de energie
moeten zorgen. Wanneer er dan een fout wordt weggehaald, blijft er een kaal 5’ over, die DNA replicatie
beëindigd → zou geen proofreading kunnen plaatsvinden.
Voor de leading strand is alleen een primer nodig aan het begin van de replicatie. Voor de lagging strand moeten
er voor elk Okazaki fragment een worden gemaakt.
DNA primase gebruikt ribonucleotide trifosfaten
om korte RNA primers te synthetiseren.
Omdat de RNA primer een 3’ OH uiteinde
heeft kan DNA polymerase de streng verlengen.
Bij het verlengen van Okazaki fragmenten stopt
DNA polymerase wanneer die een nieuw 5’
, Molecular Biology of the Cell (sixth edition) – Alberts – Deeltoets 1 (H5, H6, H4, H7 & H9)
tegenkomt van het vorige fragment. DNA repair systeem verwijdert (nuclease) de oude RNA primer en vervangt
dit met DNA. DNA ligase voegt de 3’ en 5’ van naastgelegen Okazaki fragmenten samen. Er wordt een RNA
primer gebruikt (die later wordt verwijderd) en niet een DNA primer omdat een enzym dat zelf begint met een
keten niet efficiënt kan zijn bij zelfcorrectie. Daarnaast wordt door RNA de sequentie gelabeld, zodat het repair
systeem ze kan opsporen.
DNA dubbele helix is erg stabiel bij fysiologische condities. Er is veel energie nodig om de twee strengen uit
elkaar te halen, wat nodig is voor DNA replicatie. DNA helicase gebruikt ATP om de dubbele helix te kunnen
openen. Helicases gaan over een streng van het DNA en kunnen 3’→5’ en 5’→3’ (beide helicase bestaan). Best
begrepen systeem (bacterie) gaat van 5’→3’, over de lagging strand-template. Single-strand DNA-binding (SSB)
proteins (=helix-destabilizing proteins) binden sterk en coöperatief aan blootgestelde DNA streng zonder de
basen te bedekken (blijven beschikbaar als template). Ze stabiliseren de ontwonden enkelstrengs conformatie,
worden routinematig gevonden in de lagging strand en voorkomen de vorming van haarspeldhelices.
Sliding clamp zorgt ervoor dat de polymerase stevig op het DNA wordt gehouden wanneer deze beweegt. Het
bevestigen van de clamp rond het DNA heeft ATP hydrolyse nodig en gebeurt door de clamp loader. Op de
leading en lagging strand wordt gebruik gemaakt van een clamp, maar op de lagging strand wordt de polymerase
overgegeven van sliding clamp naar sliding clamp.
Meeste eiwitten hiervoor besproken zitten samen in
een groot complex.
Strand-directed mismatch repair system detecteert het
potentieel voor vervorming in de DNA-helix door de
misfit tussen niet-complementaire basenparen. →
moet de verkeerde nucleotide verwijderen uit de
nieuwe streng en niet de template (anders wordt de
template aangepast). Herkenning nieuwe streng E. coli:
A in sequentie GATC worden gemethyleerd, maar wel
pas enige tijd nadat A is opgenomen in de nieuwe streng.
Enige GATC’s die nog niet zijn gemethyleerd (Dam methylation) zitten in de
nieuwe streng net achter de replicatievork. Herkenning van deze
ongemethyleerde sequenties zorgt voor onderscheiden van nieuwe streng. In
eukaryoten: nieuw gesynthetiseerde lagging strand DNA bevat tijdelijk insnijdingen:
nicks (= “single-strand breaks”). Deze zorgen voor signaal die het mismatch
proofreading systeem naar de goede streng leidt. Leading strand moet
ook deze nicks bevatten (hoe dit gebeurt is onzeker).
Door het ontwinden van DNA, wordt het overwonden voor de
replicatievork → DNA topoisomerases verwijderen deze torsiestress. Ze
koppelen zichzelf covalent aan een backbone fosfaat, waardoor een
fosfodiesterbinding wordt verbroken in een streng. Deze binding hervormt
als het eiwit weggaat.
Twee soorten:
- Topoisomerase I: produceert enkelstrengsbreuk → covalente binding aan een kant met
fosfaat → beide delen van DNA helix kunnen zo vrij roteren
- Topoisomerase II: produceert dubbelstrengsbreuk → vormt covalente koppeling met beide
strengen van de helix op hetzelfde moment. Bij delen waar twee dubbele helices elkaar kruizen
= supercoil. I.t.t. topoisomerase I heeft topoisomerase II ATP nodig. Het
breekt een DNA dubbele helix, zo ontstaat er een DNA “gate”, vervolgens
zorgt het ervoor dat de andere helix door deze doorgang gaat. Daarna
wordt de breuk hersteld en
dissocieert het eiwit van het DNA.
(voor plaatjes zie volgende blz.)
Initiator eiwitten binden aan het
dubbelstrengs DNA en wrikt de twee strengen uit elkaar (waterstofbruggen verbroken). Positie waar DNA helix
als eerste wordt geopend heet replication origin. Deze bestaat uit korte sequenties die initiator eiwitten
aantrekken en stukken DNA die makkelijk te openen zijn → rijk aan A-T baseparen (2 waterstofbruggen, i.t.t. tot
C-G met 3 waterstofbruggen).
Bacteriële chromosomen hebben vaak 1 origin of replication.
Bacterie: initiator eiwitten destabiliseren helix, 2 helicases
binden helicase loader, helicase actief, DNA primase synthetiseert
RNA primers, replicatie machine vormt met replicatievork.
Initiatie gebeurt alleen als er genoeg nutriënten aanwezig zijn.
Na replicatie worden de initiatie eiwitten inactief, zodat er maar
, Molecular Biology of the Cell (sixth edition) – Alberts – Deeltoets 1 (H5, H6, H4, H7 & H9)
een replicatie plaatsvindt per celdeling. Inactief door hydrolyse van
gebonden ATP. Origin of replication heeft refractoire periode door
vertraging in methylering van nieuwe A’s in de origin. Initiatie kan pas
plaatsvinden wanneer alle A’s gemethyleerd zijn en de initiator eiwit
terug is in ATP-gebonden staat.
Eukaryoten hebben meerdere origins of replication per chromosoom.
→ 30000-50000 per celdeling in totaal.
DNA replicatie in meeste eukaryotische
cellen gebeurt alleen tijdens de DNA
synthese fase/S fase. Replicatie origins
worden niet allemaal tegelijk geactiveerd,
maar in clusters, volgorde hangt af van
chromatine structuur.
Meeste DNA sequenties die kunnen
dienen als replication origins bevatten:
- Een bindingsplaats voor een groot
multisubunit initiatie eiwit genaamd
ORC (origin recognition complex)
- Stuk DNA rijk in A-T
- Tenminste een bindingsplaats voor
Eiwitten die ORC binding faciliteren
Polδ → lagging (okazaki), Polε → leading
Origin of replication kan alleen gebruikt
worden als een prereplicatief complex
vormt in G1 fase (zie plaatje met ORC). Aan
het begin van de S-fase, fosforyleren kinases helicase en ORC (activeert helicase en inactiveert ORC). Een nieuw
prereplicatief complex kan niet vormen tot de volgende G1 fase, wanneer ORC wordt gedefosforyleerd.
Eukaryote Mcm helicase gaat over leading template en bacteriële Mcm helicase over lagging template.
Naast dat DNA gerepliceerd wordt moeten in eukaryoten ook eiwitten die in
chromosomen zitten worden gemaakt. Chromatine bestaat uit nucleosomen, die
bestaan uit DNA en eiwitten (histonen). Histonen worden grotendeels gemaakt in de
S-fase. Efficiënte replicatie heeft chromatine remodeling complexen nodig om DNA-
histon oppervlakte te destabiliseren. Wanneer een nucleosoom wordt doorkruist door
een replicatievork, lijkt histon opgebroken te zijn in H3-H4 tetrameer en twee H2A-H2B
dimeren. H3-H4 blijft losjes geassocieerd met DNA → willekeurig doorgegeven aan
een van de twee dochter duplexen. H2A-H2B dimeren komen compleet vrij van DNA.
Nieuwe H3-H4 vullen gaten op, half oude H2A-H2B/half nieuwe worden willekeurig
toegevoegd om complete nucleosomen te krijgen. Lengte Okazaki fragment bepaald
door punt waar Polδ wordt geblokkeerd door nieuw gesynthetiseerd nucleosoom.
Lengte okazaki fragment ≈ nucleosoom repeat lengte. Vorming van nucleosoom heeft
histonchaperones (=chromatin assembly factors) nodig. Deze worden geleid naar
nieuw DNA door interactie met sliding clamp (PCNA).
Aan het einde van de lagging strand blijft, als de RNA primer wordt weggehaald, geen
3’ OH over voor repair polymerase om de primer te vervangen door DNA. Als dit niet
zou worden opgelost, zou een chromosoom elke celdeling korter worden.
Bacteriën lossen dit probleem op door circulaire chromosomen te hebben. Eukaryoten
hebben speciale nucleotide sequenties aan het uiteinde van chromosomen, die een
structuur vormen genaamd telomeren. Telomeren bevatten tandem repeats van korte
sequenties (gelijk tussen diverse organismen). Mensen: GGGTTA. Sequentie-
specifieke DNA bindingproteins herkennen telomeren en trekken telomerase aan.
Telomerase herkent uiteinde van bestaande telomeer en verlengt deze in 5’→3’.
Gebruikt daarbij een RNA template (component van enzym/reverse transcriptase)
→ nieuwe kopieën van repeat worden gemaakt. Vervolgens kan DNA-polymerase de
extensie gebruiken om het chromosoom af te maken (wel eerst primer nodig).
Telomeren moeten niet gezien worden als DNA schade, anders “maakt” de cel de
telomeren en ontstaan er genetische abnormaliteiten. Speciale nuclease knipt 5’
beetje af, wat een enkelstrengs uiteinde achterlaat. Dit einde samen met repeats
trekt groep eiwitten aan die beschermend chromosomen cap (= shelterin) maakt.
