College aantekeningen
College aantekeningen Genetica En Evolutie
- Instelling
- Universiteit Van Amsterdam (UvA)
Aantekeningen van de colleges van Genetica en Evolutie.
[Meer zien]Voorbeeld 3 van de 18 pagina's
Voorbeeld 3 van de 18 pagina's
In winkelwagengesponsord bericht van onze partner
Verkoper
Volgen
Voorbeeld van de inhoud
GENETICA EN EVOLUTIE DT2Griffiths H10, 13, 14, 18 t/m 20
H10 GENE ISOLATION AND MANIPULATION
1. DNA EXTRACTIE
Om DNA van individuen te kunnen vergelijken om te kijken of iemand bijvoorbeeld genen heeft
voor een specifieke ziekte moet je eerst DNA extractie uitvoeren. Daarbij haal je DNA uit een cel
en zorg je dat het los komt te liggen van alle eiwitten etc.
• Dit doe je bij mensen door wangslijmvliescellen (op een wattenstaafje) in een lysis oplossing te
leggen. De lysis oplossing bevat detergent, dat ervoor zorgt dat de cel opengaat en het DNA
vrij kan komen, en het enzym proteinase K dat het DNA losknipt van de histonen.
• Vervolgens voeg je een zout oplossing toe die ervoor zorgt dat de eiwitten en andere restanten
samenklonteren, die zakken naar de bodem bij centrifugeren waarna je in het vloeistof alleen
DNA overhoudt.
• Als je dan alcohol toevoegt gaat het DNA samenklonteren en kun je de vloeistof verwijderen.
Wat overblijft is de DNA extractie.
2. PCR (Polymerase Chain Reaction)
Om het DNA te kunnen analyseren is er veel meer van nodig. Om het stukje wat je wilt analyseren
te kopiëren kun je PCR toepassen. Bij PCR wordt gebruik gemaakt een enzym wat bij hele hoge
temperaturen kan overleven en zijn functie kan uitoefenen, TAQ polymerase.
Bij de DNA extractie voeg je:
• 2 DNA primers (die elk kunnen binden aan de uiteinden van de stukken die je wilt analyseren)
• Nucleotiden (binden aan enkele DNA streng om kopie te vormen)
• TAQ polymerase (bindt op primer om nucleotiden aan DNA streng te binden)
Deze oplossing stop je in een DNA thermal cycler, die de temperatuur regelt:
1. Bij 95℃ komen de DNA strengen los van elkaar
2. Bij 50℃ binden de primers aan het DNA
3. Bij 72℃ (bij deze temperatuur werkt TAQ polymerase het beste) bindt TAQ polymerase
aan de primers en maakt de nucleotiden om een kopie te vormen vast.
4. Dit herhaalt zich totdat er uiteindelijk meer dan een miljard kopieën van het stukje DNA zijn.
3. GELELEKTROFORESE
Om de stukjes DNA van op te kunnen delen in grootte wordt er
gebruik gemaakt van gelelektroforese. Je maakt als eerste een gel
van agarose en buffer (zout oplossing zodat elektriciteit beter kan
worden geleiden), met aan het einde kleine gaatjes waar de DNA
oplossing in kan. Je laat de gel uitharden en plaats deze in een bak
met daarin buffer oplossing, in de gaatjes pipetteer je de DNA
oplossing(en), met loading buffer (geeft het DNA kleur), die je wilt
onderzoeken en een “DNA size standard” oplossing die stukjes DNA bevat waarvan de lengtes
bekend zijn, daarmee kun je het DNA wat je bekijkt vergelijken.
Om je DNA te “runnen” sluit je het aan op een stroomvoorziening, zo wordt de ene kant van de gel
(waar je DNA zit) negatief geladen en de andere kant positief geladen. DNA zelf is negatief
geladen en zal dus richting de positieve kant gaan. De korte stukken DNA zullen veel sneller door
de gel gaan dan de lange stukken DNA, de langere stukken DNA blijven hangen. Zo krijg je aan
het einde een gel waaraan je kunt aflezen hoe lang je stukken DNA zijn.
4. cDNA
Stel je wilt een bepaald gen tot expressie brengen in een ander organisme, dan moet je dat gen
eerst kunnen isoleren. Dan kun je gebruik maken van cDNA.
Je wilt alleen het eiwitcoderende deel van het DNA dus je isoleert eerst het mRNA. Belangrijk bij
het isoleren van mRNA (als je het in een buisje hebt) is dat je de RNAse activiteit remmen. Je kunt
1
,het “bevriezen” door er vloeibare stikstof overheen te gooien maar je kunt ook een stof toevoegen
die de RNAse activiteit tegenhoudt.
In de oplossing zitten een heleboel metale balletjes met poly-T-staarten, die binden aan de poly-A-
staarten van het mRNA. Je kunt dan met een magneet alle mRNA eruit halen.
Van dat mRNA wil je cDNA maken, dat gebeurd met reverse transcriptie, RNA wordt terug
omgezet naar DNA. Je houdt dan een stukje cDNA over. Dat kun je met PCR vermenigvuldigen.
Om dat gen tot expressie te kunnen brengen in een organisme, plak je het cDNA in een vector
(circulair DNA) op restrictie sites (plekken waar enzymen kunnen knippen om iets tussen te
plakken). Er ontstaan dan plekken met een overhang met een specifieke sequentie. Om te zorgen
dat het cDNA op die restrictie sites past moeten er “sticky ends” aan worden gemaakt, sequenties
die complementair zijn aan de overhang sequenties.
Hoe zorg je dat het cDNA “sticky ends” heeft?
Daar zijn twee methoden voor:
2. Gebruik speciale PCR primers om aan je gekloonde DNA “sticky ends” te maken
• Je maakt primer die gedeeltelijk aan het DNA bindt, primer is te lang
• Het te lange stuk bevat de sequentie die je nodig hebt
3. Ligeer adapters die de gewenste restrictie sites bevatten aan je cDNA (“linkers”)
• Met ligase ligeer je de linkers aan je cDNA
- Linkers zijn kleine stukjes DNA die restrictie sequenties hebben
• De linkers komen aan beide kanten van je cDNA te zitten, je houdt dan cDNA met “sticky
ends” over.
Transfectie: het overzetten van DNA van de ene cel in de andere cel.
5. MICROARRAY
Met behulp met microarray kun je kijken welke genen uit het hele genoom bijvoorbeeld
tot expressie komen bij geïnfecteerde organismen en niet bij niet-geïnfecteerde
organismen. Uit de twee organismen isoleer je mRNA, waarvan je met reverse
transcriptie cDNA maakt. Het cDNA van het geïnfecteerde organisme geef je een kleur
(rood) en het cDNA van het niet-geïnfecteerde organisme een andere kleur (groen).
Je gebruikt een soort chip (microarray) met allemaal kleine gaatjes die elk horen bij
een gen, in elk gaatje zit het stukje DNA die hoort bij een bepaald gen van het genoom.
Zo’n microarray kun je gewoon kopen, daar zitten die stukjes DNA
al in.
Je mengt het gekleurde cDNA van de geïnfecteerde en niet-
geïnfecteerde organismen en pipetteert dat over de microarray. De
genen die tot expressie komen (“aan” staan) binden aan de stukjes
DNA op de microarray. Als je de microarray met de computer gaat
bekijken kun je aan de kleur zien welke genen tot expressie komen.
Als een stipje rood gekleurd is komt dat gen tot expressie in het
geïnfecteerde organisme, als het groen gekleurd is komt het gen
tot expressie in het niet-geïnfecteerde organisme, als het gemengd
is komt het in beide tot expressie en als het stipje niet gekleurd is
komt het in beide niet tot expressie.
2
, H14 GENOMES AND GENOMICS
1. SANGER SEQUENCEN
Frederic Sanger
Ontving twee navelprijzen
• Voor het ontdekken van de eiwitstructuur insuline
• Voor radioactief Sanger sequencen (basen een voor een
lezen)
Sequencede het eerste genoom
• Bacteriofaag 0X174, 5400 basen (11 genen)
• Heeft hij met de hand gesequenced, PCR zonder
thermocycler.
Sanger sequencing
Sanger sequencede het genoom met nucleotiden die hij modificeerde. Hij haalde de OH-groep,
waar normaal de volgende nucleotide zich aan bindt, weg zodat er vanaf dat punt geen
nucleotiden meer aan vast gemaakt kunnen worden en daar de PCR reactie dus stopt. Hij
gebruikte 4 epjes met het DNA en daarbij stopte hij naast alle normale nucleotiden ook de
gemodificeerde nucleotiden. In één epje stopte hij ook de gemodificeerde Thymine nucleotiden,
in een andere de gemodificeerde Adenine nucleotiden, in weer een andere de gemodificeerde
Cytosine nucleotiden en in de laatste de gemodificeerde Guanine nucleotiden. Bij het kopieren
van het DNA werden er soms de gemodificeerde nucleotiden ingebouwd. Uit de verschillende
epjes kon hij aflezen op welke lengte (welke base) de T, A, C of G nucleotiden zaten.
2. HUMAN GENOME PROJECT (HGP)
Eerste human genome project. Het sequencen was heel duur. NIH (National Insitutes of Health
US) wilde niet mee werken aan dit project. Department of Energy (DoE, had de atoombom
ontwikkeld) wilde hier wel aan meewerken, regelde geld voor een 15 jaar durend project dat begon
in 1987. Miljard dollar voor de eerste 7 jaar. Het werd gedaan in Los Alamos, New Mexico.
Toen NIH zag dat er geld was te verdienen wilde ze ook onderzoek doen en begint een
rivaliserend project. Dat werd rommelig, twee projecten door elkaar. De projecten zijn toen
samengevoegd in het National Center for Human Genome Research en James Watson kreeg daar
de leiding over. Zo ontstond het tweede human genome project.
Om wetenschappers gerust te stellen dat er iets gebeurde met al dat geld gingen ze ook muizen
en fruitvliegjes sequencen om te laten zien wat ermee gedaan kon worden. Genomische kaart van
alle genen op alle chromosomen maken. Dat maakte het project internationaal.
In het derde termijn was er een neurobioloog van NIH die genen wilde gaan patenteren terwijl de
functies van die genen nog niet eens bekend waren. Er ontstond een angst voor “genome grab”.
Dat is eigenlijk pas kort geleden opgelost (2015), je kunt nu niet zomaar meer genen patenteren.
• Genen die in de natuur voorkomen (o.a. dus in mensen) zijn niet meer te patenteren.
Synthetisch DNA is wel te patenteren.
- Bijvoorbeeld gemodificeerde genen en cDNA
Craig Venter ontwikkelde een methode om mRNA in cDNA om te zetten. Daarmee gingen de
kosten om een gen te ontdekken van 50.000 dollar naar 20 dollar per gen. Hij verliet in 1992 NIH
en zette zijn eigen bedrijf op (non-profit): The institute for Genomic Research (TIGR)
3. VERSCHIL TUSSEN HGP EN TIGR
HGP: arbeidsintensief
Hun methode:
1. Eerst genetische kaart ontwikkelen (heel duur)
2. Dan elk chromosoom in segmenten verdelen
3
Voordelen van het kopen van samenvattingen bij Stuvia op een rij:
Verzekerd van kwaliteit door reviews
Stuvia-klanten hebben meer dan 700.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet je zeker dat je de beste documenten koopt!
Snel en makkelijk kopen
Je betaalt supersnel en eenmalig met iDeal, creditcard of Stuvia-tegoed voor de samenvatting. Zonder lidmaatschap.
Focus op de essentie
Samenvattingen worden geschreven voor en door anderen. Daarom zijn de samenvattingen altijd betrouwbaar en actueel. Zo kom je snel tot de kern!
Veelgestelde vragen
Wat krijg ik als ik dit document koop?
Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.
Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?
Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.
Van wie koop ik deze samenvatting?
Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper amber-cn. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.
Zit ik meteen vast aan een abonnement?
Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €4,49. Je zit daarna nergens aan vast.
Is Stuvia te vertrouwen?
4,6 sterren op Google & Trustpilot (+1000 reviews)
Afgelopen 30 dagen zijn er 66579 samenvattingen verkocht
Opgericht in 2010, al 14 jaar dé plek om samenvattingen te kopen