Exoom = alle exonen
Zoektermen OMIM:
- Progressive degeneration retina (Progressieve degeneratie van het netvlies)
- Early aduldhood (vanaf vroege volwassenheid, 22e)
- Night blindnes (slecht zien in het donker)
- Degeneration Central vision (Langzame afname centrale gezichtsveld)
* + zijn genen
# % zijn ziekten
- AD= autosomal dominant
- AR = autsomaal reseccief
- XR = x-linked receccief
- …
Mendeliaanse overervingspatroon: je kijkt hoe de ziekte overerft, bv autosomaal recessief,
x-chromosomaal dominant, enz
- Uit twee gezonde ouders komen gezonde kinderen, volgende generatie heeft dan wel
weer ziekte: recessief allel ziekte.
- Zie bijlage stambomen!
Wij denken dat dit de ziekte van Petra is:
RETINITIS PIGMENTOSA 9; RP9
# 180104
,Stamboom op thema toets
Eerste sequencing methode is nog steeds de beste: Sanger sequencing
Lang stuk (meer dan 50 aminozuren) zonder stop codon heet ORF: open reading frame
Snp = single nucleotide polymorfism
Op een plek kan de nucleotide een andere letter zijn.
Annotatie = informatie over data
In vitro: in reageerbuis
In vivo: in levend organisme
In situ: op de plek zelf
Primer:
- klein stukje DNA dat als start dient voor wanneer er begonnen moet worden met het
maken van de PCR
- Belangrijke eigenschap primer: primer moet uniek zijn voor het genoom. Tussen de
18 en de 25, maar het liefst 20 nucleotiden achter elkaar.
- Primers hebben een richting, ze gaan altijd van 5’ naar 3’:
o Forward primer (fw): wordt de 5’ 3’ . De forward primer bint aan de 3’ 5’
streng, dus let op welke nucleotiden er op de primer komen.
o Reverse primer (rv): wordt de 3’ 5’. De reverse primer bint aan de 5’ 3’
streng. Je leest DNA altijd van 5’ 3’, dus achterstevoren. [?]
- Primer moet buiten het CDS, in UTR = untranslated region
- Energie komt vrij door het afknippen van 2 fosfaat van de suikergroep ofzo [?]
mRNA en DNA is altijd van 5’ naar 3’ in databases (de onderste van DNA is dan natuurlijk
andersom)
Promotor: stukje sequentie dat aangeeft de een gen begint, en vanaf wanneer RNA
polymerase moet dus gaan transcriberen.
,Het PCR en primer principe: 5
.
4
2 .
.
1
.
6
3 .
.
Wat er gebeurt: je hebt bij stap 1 een DNA molecuul. Door denaturatie smelten de strands
open. Dan ben je bij stap 2. Daarna gaan de primers op de DNA sequentie. De forward
primer bindt aan de 3’ 5’ strand (stap 3). Let dus goed op welke nucleotiden de primer
moet hebben, om dan tegenover die strand te kunnen liggen. De forward primer wordt dus
zelf de 5’ 3’. De reverse primer bindt aan de 5’ 3’ strand (stap 4). De reverse primer
wordt dus zelf de 3’ 5’. Maar let op bij het aflezen! Je moet DNA altijd van 5’ 3’ lezen,
dus voor de reverse primer begin je aan de 5’ en ga je naar de 3’. Zie onderstaande
afbeelding. Polymerase bindt zich aan de primer en begint vanaf daar met het leggen van de
nucleotiden (stap 5 en 6).
,Je doet meerdere cycles in de PCR. Je wilt uiteindelijk deze versies hebben, met de goede
lengtes.
Voor weektaak 2 moeten wij een forward en reverse primer maken, met de volgende eisen:
De forward primer bevindt zich in de 5 UTR en de reverse primer in de 3 UTR
5' en 3' kant van de primers
Lengte primers (minimaal 18, maximaal 25)
GC percentage primers
Theoretische smelttemperatuur (Tm) van de primers (Gebruik hiervoor de
vuistregel: G en C 4°C, A en T 2°C, dus het aantal GC x 4 en het aantal AT x 2 bij
elkaar optellen). De temperatuur van de 2 primers moet zo dicht mogelijk bij
elkaar liggen, maximaal 5 C verschil, maar het beste 0! Rond de 55 – 62 C is het
best. De temperatuur waarbij precies 50% van de primers vast zitten en 50% los zit.
Lengte geamplificeerde fragment(lengte forward primer + lengte sequentie + lengte
reverse primer)
Geen complentaire regio’s. Dat ze dus niet aan elkaar kunnen binden.
o Primer dimer: de twee verschillende primers binden echt aan elkaar.
o Primer hairpin: één primer bindt met zichzelf. (vorm een soort lusje)
GC klem: het eind van de primer moet goed vast zitten, dus c/g op het eind van
primer! (dus dat is de 3’ kant van de fw en rv primer)
GC percentage tussen 40 en 60 procent.
Geen repeats: vaak dezelfde nucleotide.
Je vindt de mRNA sequentie zo:
,Je klikt hier
Dan klik je onder DNA op NCBI RefSeq
Dan kom je op de NCBI site en zie je resultaten. Kies niet de PREDICTED resultaten, want
dat zijn voorspellingen. Kies ook niet non coding mRNA (zit in de titel). Kies het bovenste
resultaat dat aan de eisen voldoet. Daarna kom je op een normale NCBI site en staat
helemaal onderaan de sequentie.
Accessiecode van het uiteindelijk PRPH2 van PH7 is: NM_000322
,Maken van primer:
,Op het tentamen moet je met de hand een primer kunnen schrijven!
PCR:
- DNA template
- Taq DNA polymerase: thermus aquarius bacterie. Werk sneller maar maakt
statistisch gezien een fout van 1 op 1000, geen proof reading.
- Nucleotiden: dNTPs
o d: deoxy - DNA
o N: kan A,T,G,C zijn
o TPs: tri fosfaat
- 2 ssDNA primers
- Buffer (incl MgCl) + water: co-factor. Een lading zodat het eiwit actief wordt.
PCR processen:
- Denaturatie: DNA wordt verhit tot 94 C. Waterstofbruggen gaan kapot, ion-bindingen
blijven bestaan.
- Annealing: primers binden. De temperatuur is 4 C lager dan Tm (smelttemperatuur)
[?]. Wanneer er dan primers opzitten, dan blijven die er ook opzitten.
- Extension/elongation[?]: polymerase verlengt primers bij 72 C
Polymerase houd op totdat het DNA op is, of totdat je onder de 94 C gaat.
Polymerase met proof reading: polymerase die controleert bij elke nucleotide of het de goede
is, maar werkt trager.
Onze primers:
Forward primer
- 5’ – acccggactacacttggcaa – 3’
- Lengte primer: 20 nt
- GC% primer: 55,0%
- Tm primer: 62 °C
- Lengte geamplificeerde fragment: 1100 nt
Reverse primer
- 5’ – tttctcagtgttcgggaggg – 3’
- Lengte primer: 20 nt
- GC% primer: 55,0%
- Tm primer: 62 °C
- Lengte geamplificeerde fragment: 1100 nt
,dbSNP: database singel nucleotide polymorphism.
Twee tools ontwerpen primer:
- Primer-BLAST
- Primer3Plus
Self complementair moet zo laag mogelijk zijn!
In primer blast kun je zelf je primers ook invoeren
SNPS zijn begonnen als natuurlijk voorkomende mutaties, maar vallen niet meer onder de
mutaties. Mutaties zijn dingen waarbij er echt gemuteerd wordt, bijvoorbeeld door straling.
Verschillende soorten mutaties:
- Puntmutatie: verandering op enkele plaats in het DNA, dat kan leiden tot een eiwit dat
minder functioneel is of juist functioneler.
- Baas-paar substitutie:
o Silent mutaties: mutatie nucleotide, maar aminozuur blijft hetzelfde.
o Missense mutatie: mutatie nucleotide, ander aminozuur
o Nonsense mutatie: mutatie nucleotide, stopcodon komt eerder/later, eiwit
wordt korter/langer
- Baas-paar insertie of deletie:
o Frameshift, veroorzaakt nonsense: eerder/later stopcodon
o Frameshift, veroorzaakt missense: missende letter, ander aminozuur
o Geen frameshift, maar 3 deletie van 3 base-paren: het missen van een
amionzuur.
,Primer-BLAST: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?
LINK_LOC=BlastHome
De pagina ziet er zo uit:
Je voert hier je accesiecode in.
Vervolgens geef je de regio van de forward primer en de reverse primer aan.
- Forward primer: 1 – [begin locatie CDS]
- Reverse primer: [eind CDS] – [eind sequentie]
Daarna voer je bij PCR product size het minimum en maximum in:
- Minimum: lengte CDS
- Maximum: eind sequentie
, Je scrolt iets naar beneden. Als database kun je Refseq mRNA houden. Organisme in dit
geval Homo Sapiens
Vervolgens klik je op Get Primers. Het moet even laden, en dan krijg je je resultaten.
Primer3Plus: http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi
De pagina ziet er zo uit:
Je voert hier je sequentie in (copy – paste)
