Case uitwerking
Report enzymatic assays
Case of 9 pages for the course Practical Lab Skills For Animal Sciences at WUR (Compleet rapport)
[Meer zien]Voorbeeld 2 van de 9 pagina's
Voorbeeld 2 van de 9 pagina's
In winkelwagengesponsord bericht van onze partner
Voorbeeld van de inhoud
IntroductionThe aim of this experiment is to determine the effect hydrogen peroxide
(H2O2) has on different enzymes from the citric acid cycle. A routine
requirement of enzyme assays is to first determine the protein
concentration. For this protein quantification, a colorimetric method
termed detergent compatible (DC) protein assay from Bio-Rad is used.
Figure 1 illustrates that Folin-Ciocalteau reagent together with cupric
Figure 1: Biuret and Folin-Ciocalteau reaction
sulphate solution causes a blue-purple colour to be produced that can be
quantified by its absorbance. The intensity of the colour is proportional to the amount of protein in
the sample. A surfactant is used to reduce surface tension.
After protein quantification, enzyme activity of aconitase
and citrate synthase will be measured at different H 2O2
concentrations. Oxidative stress caused by H 2O2 is expected
to inhibit enzyme activity. Aconitase catalyses isomerization
of citrate into isocitrate, as demonstrated by figure 2. The
amount of isocitrate can then be measured by adding
oxidized nicotinamide-adenine-dinucleotide phosphate Figure 2: Aconitase isomerization
+
(NADP ) and isocitrate dehydrogenase (IDH) to initiate a colour
reaction.
Figure 3 illustrates how citrate synthase catalyses the formation of
citrate from acetyl coenzyme A (acetyl CoA) and oxaloacetic acid
(OAA). 5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) is added to
initiate a quantifiable colour reaction that is caused by Figure 3: Citrate synthase
deacetylation of acetyl CoA.
The learning goal is to gain experience with performing protein and enzyme assays.
Materials & Methods
For a more detailed protocol, consult the lab journal of week 1.
Protein quantification
First, standard curve dilutions were prepared with stock bovine serum albumin (BSA, 1.5mg/ml)
according to the schedule in table 1. Tromethamine buffer (TRIS, 50mM, pH 7.4) was used for
dilutions. The TRIS buffer an BSA solution were pipetted into Eppendorf tubes corresponding to each
dilution.
, Table 1: Standard curve dilutions. BSA with known protein concentration.
Secondly, protein sample dilutions were prepared with a sample containing proteins derived from
homogenized rat liver and followed the schedule in table 2. TRIS buffer and sample were pipetted
into Eppendorf tubes.
Table 2: Protein sample dilutions. Rat liver sample with unknown protein concentration.
A reagent mix was also prepared according to table 3. This mix consisted of alkaline copper tartrate
(A), surfactant solution (S), and Folin-Ciocalteau reagent (B). The total volume of A+S was pipetted
into 1 tube and the total volume of B in another.
Table 3: Reagent mix.
Voordelen van het kopen van samenvattingen bij Stuvia op een rij:
Verzekerd van kwaliteit door reviews
Stuvia-klanten hebben meer dan 700.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet je zeker dat je de beste documenten koopt!
Snel en makkelijk kopen
Je betaalt supersnel en eenmalig met iDeal, creditcard of Stuvia-tegoed voor de samenvatting. Zonder lidmaatschap.
Focus op de essentie
Samenvattingen worden geschreven voor en door anderen. Daarom zijn de samenvattingen altijd betrouwbaar en actueel. Zo kom je snel tot de kern!
Veelgestelde vragen
Wat krijg ik als ik dit document koop?
Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.
Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?
Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.
Van wie koop ik deze samenvatting?
Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper michouweimar. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.
Zit ik meteen vast aan een abonnement?
Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €2,99. Je zit daarna nergens aan vast.
Is Stuvia te vertrouwen?
4,6 sterren op Google & Trustpilot (+1000 reviews)
Afgelopen 30 dagen zijn er 53068 samenvattingen verkocht
Opgericht in 2010, al 14 jaar dé plek om samenvattingen te kopen