Vacuolaire systeem: nucleaire envelop, ER, golgi, endosomen, lysosomen, transportblaasjes
Mitochondriën: 1 µm (kunnen langer zijn)
Eiwitten: 10 nm
Je moet weten dat een rode bloedcel ongeveer 7 µm is
Plasmamembraan: 7 nm
Fase-contrast microscoop: Bestuderen levende ongekleurde cellen
Fluorescentie microscoop:
- Toepasbaar op zowel levende als gefixeerde cellen
- Verschil in golflengte → ander kleurtje → dat kan je zien
- UV-lamp maar tegenwoordig vaker lasers (monochroom)
- Fluorofoor: vertoont fluorescentie
H&E kleuring: DNA, RNA paars/blauw. Eiwitten: roze
Fixeren dood cellen
Productie van monoclonale antilichamen
B-cellen kun je alleen in leven houden als je ze laat versmelten met een tumorcel (myeloma)
Hybridoma: kunnen ongeremd delen → uit gekweekte cellen antilichamen halen, allemaal dezelfde specificiteit:
zelfde plek om het antilichaam te herkennen
Mono vs polyclonaal: de antilichamen kunnen maar op een plek/meerdere plekken op het antigen binden
Productie polyclonale antilichamen:
1) Antigeen injecteren
2) Antigeen activeert B-cellen (B-cel receptor → voorloper antilichaam)
3) Plasma B cellen produceren polyclonale antilichamen
4) Verkrijg antiserum van konijn wat polyclonale antilichamen bevat
Detectie van een specifiek antigen met fluorescente antilichamen:
- Weefsel fixeren, inbedden en coupes maken → niet nodig voor losse cellen of cellen gekweekt op een glaasje
- Permeabiliseren van membraan mbv detergenten (zeepachtige stof) → bv actine in de cel leveren
- Immuno-labelen met antigen specifieke fluorescente antilichamen → antilichamen zijn gekleurd en binden met
het antigen in de cel, soms een secundair antilichaam vast aan het primaire
- Fluorescentie-microscopie
Green fluorescent protein: GFP
- Hybride gen maken
- Transfectie: de gehele constructie in een cel brengen
- Kan aan N-terminus, C-terminus en het midden zitten
- Soms beïnvloed de binding van GFP de werking → zoeken naar een construct waar de functie vh eiwit niet
verloren gaat door de tag
Prokaryoten:
- Erfelijk materiaal opgeslagen in circulair DNA-molecuul
- Geen intracellulaire membranen → geen kern, ER, endosomen
- Wel plasmamembraan, sommige hebben 1 anderen hebben 2
- Nucleoid: kern met eiwitten en DNA los in de cel
- Gram positieve bacteriën hebben geen buitenste membraan
Eukaryoten:
- Eencellige (bv. gist) of meercellige organismen (planten en dieren)
- Erfelijk materiaal opgeslagen in lineaire DNA-moleculen (chromosomen verpakt in de kern)
Vacuolaire systeem: nucleaire envelop, ER, golgi, endosomen, lysosomen, transportblaasjes
,Het hele vacuolaire systeem is ontstaan, direct of indirect als gevolg vd instulping vd plasmamembraan.
Peroxisomen niet → ze krijgen geen nieuwe eiwitten via het vacuolaire systeem
Mitochondriën:
- Geen onderdeel van het vacuolaire systeem → apart ervan geëvolueerd → wel soort symbiose geworden
- Wss via endocytose een prokaryote cel opgenomen, nu zitten ze er al
- Mitochondria kan niet bestaan zonder eukaryote cel en andersom ook niet → mitochondria genereert 90% vd
ATP
- Dubbelmembraan → binnenste van prokaryoot en buitenste van plasmamembraan van endocytose
- Hebben eigen DNA → kunnen delen en zelf eiwitten maken + bevestigd ontstaan uit prokaryote cel
- DNA codeert nog maar voor 13 eiwitten en ribosomale eiwitten → RNA-moleculen belangrijk voor genereren
eiwitten → grootste deel vd eiwitten wel gecodeerd door de kern → symbiose geworden
- Binnenste membraan maakt cristae → membraanoppervlak vergroten
Peroxisomen:
- Ontstaan aan het ER
- Daarna niet verbonden met vacuolaire systeem
- Omgeven door enkele membraan
- Lijken op lysosomen → zit een eiwit in belangrijk voor de oxidatie van langketenige vetzuren en toxische
stoffen
- Egaal grijs met kristallijne eiwitstructuur
- Hybride molecuul: wel ontstaan maar daarna niet meer verbonden met vacuolaire systeem
Cytoplasma = alles binnen de cel, inclusief organellen minus de kern
Cytosol = cytoplasma minus alle celorganellen → 50% van cytoplasma. Sol van soluble: oplosbaar
1 kern → ook 1 ER en 1 golgi
Evolutionaire voordelen om functies te compartimenteren;
- Organel-specifieke milieus → geoptimaliseerd voor specifieke taken → zuur milieu in lysosoom → daarom
alleen daar eiwitten afgebroken
- Scheiding opeenvolgende taken
- Regulatie genexpressie (kern-envelop) → niet alle genen staan aan → transcriptiefactoren bepalen of ze
aan/uitstaan → de kernenvelop bepaalt of de transcriptiefactoren wel of niet in de kern zitten
- Vergroting membraanoppervlak voor membraan afhankelijke reacties/taken
De plasmamembraan:
- Integrale membraaneiwitten → steken door het membraan heen
- Transmembraanstuk: steekt uit in het cytosol → interactie met cytoskelet en signaleringsmoleculen
Kernenvelop met kernporiën:
Porie: macromoleculen, ionen en RNA erdoorheen
Transcriptiefactoren → gemaakt door ribosomen in het cytosol en via poriën naar kern
Soms herkent de porie bepaalde aminozuurvolgordes waardoor een transcriptiefactor wel en andere eiwitten niet
erdoor kunnen
Door binding worden bepaalde transcriptiefactoren opgenomen en bepaalde genen aangezet in de kern
Kern: regulatie celdifferentiatie met behulp van transcriptiefactoren
Nucleaire envelop voor transport, regulatie en differentiatie.
Gereguleerd eiwittransport door kernporiën welke bezet zijn door selectieve eiwitcomplexen.
Ruw endoplasmatisch reticulum (RER):
Synthese van eiwitten → membraaneiwitten en lumeneiwitten vh vacuolaire systeem, plasmamembraan eiwitten,
secretie eiwitten
Cisterne op elkaar gestapeld
Transcriptiefactor → eiwit dat kan binden aan een stukje DNA (promotor) op een chromosoom dat er
verantwoordelijk is dat het gen dat naast de promotor ligt afgelezen wordt. Hebben signaal in het eiwit.
,Gladde endoplasmatisch reticulum (SER):
- Synthese van vetzuren en fosfolipiden (voor
membranen)
- Synthese van steroïde hormonen uit cholesterol
- Assemblage lipoproteïne partikels
- Ca2+ opslag
- Meer buisvormig
- Detoxificeren van water onoplosbare stoffen
SER + RER maken samen nieuwe membranen → ze maken eiwitten en vetten → elementen membraan
MRNA door nucleaire poriën → komt in cytosol → ribosomen hechten aan 5' terminus en dan aflezen → per 3
nucleotiden, 1 aminozuur toevoegen
Polyribosomen: meerdere ribosomen op het MRNA
Eiwit los in cytosol, als ze elders hun functie hebben (bv kern) → hebben ingebouwd signaal: targeting sequence →
bepaalde volgorde van aminozuren
Secretie eiwitten (eiwitten voor buiten de cel) of in het plasmamembraan → gekoppeld aan vacuolaire systeem →
tijdens synthese door membraan geregen: scheelt energie →
hebben ER signaal sequentie
ER signaal sequentie en ribosoom herkend en gebonden door
SRP
Eiwitten peroxisomen → gesynthetiseerd door vrije
ribosomen in het cytosol (is specifiek voor peroxisomen) → na
synthese eiwitten door membraan geregen
ER eiwitten → zit een ER signaal sequentie op → gebruikt om
al tijdens de synthese het eiwit door het membraan te rijgen
→ eiwit komt in holte ER of gedeeltelijk (wordt
transmembraaneiwit) → hierna vanuit het ER via
membraantransport naar uiteindelijke plek
Eiwitsynthese door vrije ribosomen of aan RER:
MRNA aflezen → eerste stukje gemaakt is ER signaal sequentie → wordt gebruikt om het hele complex te
dokken/plaatsen op het ER. Tijdens synthese al door membraan geregen
Eiwitsynthese aan het RER
Eiwitten voor lumen vh vacuolaire systeem en secretie → ER signaal sequentie en ribosoom wordt herkend door SRP
→ translatie even gepauzeerd. Het eerste stukje eiwit is dus wel gesynthetiseerd met het ER ss maar er treedt een
pauze op. Het SRP kan herkend worden door een receptor in de ER membraan: SRP receptor → wanneer het
herkend wordt door de receptor laat het SRP los vh ribosoom waardoor de synthese verder kan gaan maar nu aan
het ER. Door een translocatie kanaal (transmembraan eiwitcomplex in de membraan vh ER) het ER in → ER ss er
afgeknipt door signaal peptidase (kort eiwitje: peptide)
Synthese membraaneiwitten vh vacuolaire systeem of vd plasmamembraan
Eerst de N-terminus gesynthetiseerd en de C-terminus als laatste
ER ss: hydrofoob → makkelijk in membraan, als er een tweede hydrofobe sequentie is noem je dit een stop-transfer
sequentie → stopt het rijgen/de transfer vh eiwit door het membraan, kan niet door membraan, blijft er zitten.
Het eiwit wordt afgesynthetiseerd maar buiten de membraan → je hebt een transmembraaneiwit met de N-
terminus in het lumen en de C-terminus in het cytosol.
Synthese type 2 membraaneiwitten:
Andersom in de membraan kan ook → wanneer de start-transfer sequentie (ER recognition peptide) niet aan de N-
terminus zit maar een stukje ervan af. Nu steekt de N-terminus uit in het cytosol en het signaal peptide wordt er niet
afgeknipt door de signaal peptidase. Dan wordt het eiwit afgesynthetiseerd en dan krijg je dat de carboxyl terminus
uitsteekt uit het lumen.
, SRP laat los als het eiwit gedokt is aan het translocase kanaal, als het erdoorheen gaat kan het signaalpeptide door
een signaal peptidase worden afgeknipt en eiwit verder door
membraan geregen. Volledig in lumen ER, bv insuline.
Niet eraf geknipt → signaal peptide is hydrofoob transmembraan
domein, dit wordt er niet afgeknipt. Het is een type 2 transmembraan
eiwit met een omgekeerde oriëntatie
Meerdere keren door het membraan heeft stop en start transfers,
telkens hydrofobe sequenties. Na stop is de volgende automatisch een
start. Vaak 6-8 keer door membraan → multispanning membraan
eiwitten
GPI-membraananker: glycosyl-phosphatidyl-inositol
Ankertje bestaande uit vetmolecuul: GPI geankerde eiwitten. Het laatste stukje is een stop transfer sequentie en
blijft in het membraan, deze wordt eraf geknipt en dan wordt het eiwit dat losligt weer vastgezet op een anker. Dit
anker bestaat uit vetzuurstaarten in de membraan die vastzitten aan een fosfaat, inositol, glucoamine en een aantal
mannoses en dan aan het eiwit. Best veel eiwitten van cellen zijn met een GPI-anker aan de plasmamembraan
verankerd
Post-translationele modificaties in het ER
Nieuw gesynthetiseerde
membraaneiwitten en
eiwitten in het lumen vh ER
ondergaan 4 belangrijke
typen van modificaties: veranderingen:
- Vorming van disulfidebruggen
- Covalente binding aan carbohydraten: suikers
- Specifieke proteolytische klieving: geknipt na synthese
- Vouwing en assemblage in multimeer eiwitcomplex: meerdere eiwitten aan elkaar gebonden (vaak in het ER)
Disulfidebruggen worden gevormd en herschikt in het ER-
lumen door Protein Disulfide Isomerase (PDI)
Elk blauw bolletje is een aminozuur en sommige
aminozuren zijn cysteïnes, cysteïne heeft een vrije sulfadyl
groep (-SH). Meerdere cysteïnes kunnen samen een
covalente binding aangaan via een zwavelbrug →
belangrijk voor vouwing eiwit. Ontstaat redelijk spontaan
door beetje geoxideerd milieu in ER.
PDI: kan verschillende isomeren maken → kan
zwavelbruggen verbreken zodat er andere bruggen
komen, duurt een half uur. Uiteindelijk de meest
energetisch gunstige conformatie aangenomen →
vouwing compleet. Mede dankzij PDI worden eiwitten
correct gevouwen in het ER.
