100% tevredenheidsgarantie Direct beschikbaar na je betaling Lees online óf als PDF Geen vaste maandelijkse kosten
logo-home
Eerder door jou gezocht
Eerder door jou gezocht
logo
Samenvatting Gentechnologie (I0O11A) €6,49
In winkelwagen
Snel navigeren naar
Voorbeeld
  2.  
  3. Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven)
  4.  
  5. Biologie
  6.  
  7. Gentechnologie (I0O11A)

Samenvatting

Samenvatting Gentechnologie (I0O11A)

1 beoordeling
 3 keer verkocht
  • Vak
  • Gentechnologie (I0O11A)
  • Instelling
  • Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven)
  • Boek
  • Principles of Gene Manipulation and Genomics

Samenvatting van de belangrijkste informatie uit de lessen van Gentechnologie (vak van bachelor biologie minor biochemie en biotechnologie + vak van bachelor bio-ingenieur)

Voorbeeld 4 van de 54  pagina's

Document informatie

  • Ja
  • 10 februari 2022
  • 54
  • 2021/2022
  • Samenvatting

Onderwerpen

  • pcr
  • genklonering
  • expressiesystemen
  • expressievectoren
  • gentechnologie

Gekoppeld boek

book image

Titel boek:

Auteur(s):

  • Uitgave:
  • ISBN:
  • Druk:

Geschreven voor

  • Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven)
  • Biologie
  • Gentechnologie (I0O11A)
Alle documenten voor dit vak (1)

1  beoordeling

review-writer-avatar

Door: alicecallewier90 • 1 jaar geleden

Verkoper

avatar-seller
freyavandeneynde16

Ontvangen beoordelingen

Voorbeeld van de inhoud

H1: Isolatie en visualisatie
nucleïnezuren
1. Inleiding
 G en C: 3 H-bruggen A en T: 2 H-bruggen
 Atomische modificaties isotopisch labelen
(emitteren β-straling): 31P  32P/33P, 14N 
15N, 12C  13C/14C, H  3H
 Bij DNA-replicatie: desoxyribonucleotidetri-P
molecule wordt herkend obv template strand 
chemische reactie met vrijstelling pyrofosfaat
 DNA-polymerase kan geen 5’ uiteinde verlengen
 Hershey & Chase (1952): enkel DNA van faag gaat in cel  DNA bevat alle info nodig voor
reproductie van nieuwe bacteriofaagpartikels

2. Isolatie van nucleïnezuren
Globale doelstellingen van gentechnologische bewerkingen:

1. EXPLORATIE: analyse van genoom en signalen
 Prenatale diagnose, microbiologische analyses, virusidentificatie
2. GEBRUIK: expressie van eiwit in grote hoeveelheid
 Industriële productie (interferonen, insuline, agarose, amylase)
3. DESIGN: gerichte wijziging van organisme in omgeving
 Biotechnologie: inbouw nieuwe eigenschappen

Middelen voor isolatie:

Inhibitie biochemische activiteiten Snelle verwijdering nucleïnzuur van rest
- EDTA - Fenol, chloroform
- Temperatuur verlagen - Gebruik ethanol, isopropanol, PEG,
- Eiwitdenaturerende agentia spermidine, CTAB
toevoegen - Qiagen, Glassmilk (dragers waarop
nucleïnezuur bindt)
Guanidiumzouten DEPC (di-ethylpyrocarbonaat)
Chaotroop agens: vernietingt 3D-structuur Sterk alkylerend agens
 guanidium HCl: sterke inhibitor RNase  ethoxyformylering van histidylgroepen
 guanidiumisothiocyanaat: nog sterker  behandeling glaswerk en oplossingen
VRC (vanadylribonucleoside complex) Proteïne-inhibitoren van RNase
 bindt aan actieve plaats RNasen en  uit cytoplasma van bijna alle
inhibeert katalytische activiteit zoogdierweefsels
 gebruikt bij mRNA isolatie voor cDNA  RNAsin, prime inhibitor
klonering




1

, A. Bereiden van bacterieel DNA

1. Nood aan voldoende biomassa  groeimedium met
bacteriën
2. Cel lysis  cel extract
3. Centrifugatie  cell pellet (precipitatie) verwijderen 
DNA, RNA en proteine in suspensie
4. Celextract mengen met phenol  scheiden in 2 lagen na
centrifuge (fenol is zwaarder)  DNA in suspensie,
proteinen op interface

Cellysis met E. coli als waardcel:
A. Cleared lysate methode
1. EDTA + lysozyme + 25% sucrose toevoegen aan cel
 EDTA vormt complex met ionen  destabiliseren
buitenmembraan
 Lysozyme breekt peptidoglycaanlaag af
 Bacteriecel spat niet uiteen door 25% sucrose
2. Triton X-100 toevoegen aan sferoplast (geeft prikje aan cel)  celextract
3. Centrifugeren  troebele zone heeft DNA (supercoiled en open-circular) + lysaat heeft
plasmiden
B. Alkalische lysis methode (plasmide opzuivering)
1. Op en neer pipetteren  chromosomaal DNA breekt in stukken (lineaire DNA
fragmenten + supercoiled plasmide)
2. Bij pH 12: chromosomaal DNA denatureert  single stranded
3. pH 7: DNA-fragmenten vinden elkaar niet terug  niet-georganiseerde massa
4. Centrifuge  pellet van lineaire DNA-moleculen + plasmiden in oplossing
C. Kooklyse
Ruwe procedure  cellen barsten open door verhitting
D. Fenollyse
Alternatieve zeer ruwe methode (enkel geschikt voor snelle karakterisatie)

B. Opzuivering van faag DNA
Fagenpartikels zijn te klein, blijven in suspensie  cellen en debris precipiteren
1. Faagsuspensie  PEG + zout toevoegen  faagpartikels precipiteren
2. Centrifuge  onzuiverheden in suspensie verwijderen  dichtheidgradientcentrifugatie
3. CsCl in kolom gedeponeerd in verschillende conc  gelaagdheid
4. Faagpartikels volgen densiteit en gaan op specifieke densiteit stabiliseren (afhankelijk van
verhouding eiwit/DNA)  faagpartikels opzuiveren

C. CTAB methode voor isolatie plant DNA
Extratie DNA aan hoge kwaliteit waarbij minimaal DNA wordt gebroken
1. CTAB, TrisHCl, EDTA, NaCl, BME en proteinase K toevoegen aan celextract
2. CTAB treedt in complex met nucleinezuren en precipiteert (bij lage zoutconc)
3. Centrifuge (nucleinezuur-CTAB in pellet)  supernatans verwijderen
4. Resuspenderen aan hoge zoutconcentratie  DNA terug in oplossing
5. DNA zuiveren door eenvoudige stappen

D. DNA opzuivering



2

, A. Geconc DNA-oplossing met absolute ethanol  ethanol opleggen  DNA precipitatie op
interface  met glazen staaf isoleren
B. Aan 1 volume DNA 2.5x zoveel ethanol toevoegen in zoutomstandigheden  DNA
precipiteert  resuspenderen in volume naar keuze
C. Silicapartikels die door guanidium thiocyanaat (GTC) binden aan DNA  silica in kolom 
celextract erover  biochemische molecules elueren  toevoegen water  DNA in apart
recipient
D. IEX met + partikels  interageren met – DNA  zout toevoegen  RNA vrij van kolom 
hoge zoutconcentratie  DNA komt vrij
 Conventionele anion-exchangers: DEAE kern die gekoppeld is aan suikermolecules (20 A
uit elkaar): + lading die interageert met P-backbone
 Verbeterde anion-exchangers: afstand DEAE dichter bij elkaar

E. Spectrofotometrische zuiverheidsbepaling van nucleïnezuren
 Snelle, niet destructieve meting van nucleïnezuren
 Geen onderscheid tussen DNA en RNA (RNase-vrij DNa om contaminerend DNA te
verwijderen)
 Verhouding absorbantie 260/280 nm  zuiverheid DNA en RNA bepalen
Ratio van 1.8 Zuiver DNA
Ratio van 2.0 Zuiver RNA
Ratio < 1.8 Eiwit, fenol of andere contaminanten



3. Scheiding en detectie van nucleïnezuren
A. Agarose gelelectroforese

PARAMETERS DIE MIGRATIESNELHEID BEÏNVLOEDEN:

1. Agaroseconcentratie
 alternerende D- en L-(3-6-anhydro)galactose, gekoppeld door a(1-3) en b(1-4)
glycosidische bindingen  vormt 3D-structuur
 INVERS LINEAIR VERBAND TUSSEN LOG ELEKTROFORETISCHE MOBILITEIT EN
GELCONCENTRATIE
2. Moleculaire grootte
 MIGRATIESNELHEID IS OMGEKEERD EVENREDIG MET LOG RELATIEVE MOLECULAIRE
MASSA
 Voor grote DNA-fragmenten: hogere resolutie voor lage densiteit
3. Conformatie DNA
 Supercoiled is kleiner dan genikte open circulaire  sneller door matrix
 Ethidiumbromide: lading daalt; DNA minder flexibel en langer
4. Aangelegde voltage
 Typisch 5 volt per cm lengte van de gel
 Hoe hoger voltage, hoe harder DNA trekt naar + kant
 Te hoog: warmteproductie die gel doet smelten (minder zuiver)
 Low melting agarose: door hydroxy-ethylatie
 Metaphor agarose: hogere resolutie (kleinere fragmenten)

1. DNA scheiden door GE  gewenste fragment uitsnijden met scalpel
2. Agarose oplossen + mengen met silica dat chaotropisch zout bevat
3. DNA bindt aan silica matrix  onzuiverheden verwijderd door eenvoudige wasstappen

3

, 4. DNA elueren uit matrix door buffer met lage zoutconcentratie

B. Staining DNA

Intercalatie in ds-DNA is redelijk stabiel: verwijdering door diffusie is moeilijk  extractie met
butanol & iso-amylalcohol of via IEX

Ethidium bromide SYBR SYBR gold
Intercaleert tussen basenparen Asymmetrische cyanine kleur Relatief duur
Specifiek absorbantie en Geen fluorescentie in - gevoelig aan fluorescent licht
emissiespectrum oplossing, wel bij binding aan - gouden kleur
DNA/RNA
Staining: DNA in een gel bad in Gevoeliger dan EtBr: - 10x meer gevoelig
buffer met EtBr  fixatie in - niet fotostabiel - redelijke gelpenetratie
DNA & nabijheid baseringen - slechte gelpenetratie - bindt mogelijk aan
verhogen fluorescentie - niet optimaal bij 300nm fosfaatruggengraat  sterke
Toegevoegd wanneer gel vertraging en beïnvloeding van
wordt gegoten (vertraagd mobiliteit
migratiesnelheid + minder
duidelijke bandjes)
Destaining: in water of 1 mM
MgSO4
Zorgt voor foto-oxidatie van
DNA bij licht en O2
Mutagene stof
Bindt ook ss nucleinezuren 
zwakkere fluorescentie


C. Gelvrije detectie van nucleinezuren

 Microfluida, CE en fluorescente kleurstoffen  RNA/DNA concentratie en integriteit bepalen
 Heel gevoelig + precies

D. Pulsed-Field Gel Electrophorese (PFGE)

 Grote fragmenten scheiden tot 10 Mb
 Grote DNA-molecules ontrafelen en bewegen als slang doorheen gel
 Hoe groter molecule, hoe moeilijker herorientatie
1. Elektrisch veld leggen op A  molecule migreert naar rechtsboven (beweegt als slang)
2. Stroom stilleggen  stroom over B  DNA herorienteert en beweegt naar links
3. Herhaling  vorming zigzagbeweging
 PROBLEEM: fysisch lange, grote moleculen  leggen fysische stress op en kunnen
breken  cellen worden gelyseerd terwijl ze in agarose zitten, daarna rechtstreekse
scheiding

E. Immobilisatie van nucleïnezuren

 Northern blot (RNA)/ Southern blot (DNA)/ Western blot (proteïne)
 Afdruk en immobilisatie op cellulosenitraatmembraan  kunnen versterkt worden met
polyester nylonmembranen
 Capillaire transfer electro-blotting  vacuumblotting



4

Dit zijn jouw voordelen als je samenvattingen koopt bij Stuvia:

Bewezen kwaliteit door reviews

Bewezen kwaliteit door reviews

Studenten hebben al meer dan 850.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet jij zeker dat je de beste keuze maakt!

In een paar klikken geregeld

In een paar klikken geregeld

Geen gedoe — betaal gewoon eenmalig met iDeal, creditcard of je Stuvia-tegoed en je bent klaar. Geen abonnement nodig.

Direct to-the-point

Direct to-the-point

Studenten maken samenvattingen voor studenten. Dat betekent: actuele inhoud waar jij écht wat aan hebt. Geen overbodige details!

Veelgestelde vragen

Wat krijg ik als ik dit document koop?

Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.

Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?

Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.

Van wie koop ik deze samenvatting?

Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper freyavandeneynde16. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.

Zit ik meteen vast aan een abonnement?

Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €6,49. Je zit daarna nergens aan vast.

Is Stuvia te vertrouwen?

4,6 sterren op Google & Trustpilot (+1000 reviews)

Afgelopen 30 dagen zijn er 66184 samenvattingen verkocht

Opgericht in 2010, al 15 jaar dé plek om samenvattingen te kopen

Begin nu gratis
€6,49  3x  verkocht
  • (1)
In winkelwagen
Toegevoegd