Molecular cell research
Tentamen
Cytoskelet
Cytoskelet 1: Cytoskelet dynamiek
Het celskelet bestaat uit verschillende filamenten
- intermediaire filamenten
- microtubuli
- actine
Actine
Actine is dynamisch. Actine netwerk
kan snel veranderen. Het celskelet
wordt opgebouwd uit kleine
bouwstenen die gekoppeld en
ontkoppeld kunnen worden. Actine is
een globulair eiwit dat ATP kan binden
en hydrolyseren. Hydrolyse van ATP
zorgt voor een conformatieverandering.
Actine is een ATPase. Actine vormt
twee protofilamenten die om elkaar
heen een spiraalvorm vormen. De twee
uiteindes van actine zijn anders;
asymmetrische structuur heeft een plus en min uiteinde, bepaald door positionering van de
actine filamenten.
Polariteit is weer te geven door actine te bedekken
met myosine. Myosine is een motor dat aan actine
kan binden, ze hebben een bepaalde oriëntatie.
Barbed end = plus uiteinde, pointed end = min
uiteinde.
Het plus uiteinde is het uiteinde waar actine monomeren snel toegevoegd en afgehaald
kunnen worden. Dit kan ook bij het min uiteinde, maar hier gebeurd het langzamer. Dit komt
door de asymmetrische structuur van de actine eiwitten.
Actine kan geïsoleerd worden uit cellen en spontaan
polymeriseren. Eerst wordt er een oligomeer
gevormd, als deze eenmaal gevormd is kunnen
actine zowel aan het plus als min uiteinde
toegevoegd worden. Dit gaat door tot de concentratie
van actine te laag wordt voor verdere polymerisatie.
Er ontstaat een balans waar net zoveel actine wordt
toegevoegd als weggehaald. Deze steady state kan
beschreven worden door een kritische concentratie
,(Cc). Als de actine monomeer hoger is dan de kritische concentratie groeit het actine
filament (en andersom).
We beschouwen nu één van de twee
protofilamenten. De binding van een subunit
kan gedefinieerd worden door twee
constantes: Kon en Koff. Kon = constante
waarmee een subunit wordt toegevoegd.
Koff = constante die de frequentie beschrijft
waarmee een subunit van het protofilament
afvalt. Kon is afhankelijk van de
concentratie, Koff niet. Bij het equilibrium
geldt: Kon x Cc = Koff. Cc = Koff/Kon = 1/K.
K = equilibrium constante. Hoe hoger de
Koff/hoe lager de Kon, hoe hoger de Cc,
veel actine monomeren zijn nodig voor polymerisatie. Andersom zijn weinig monomeren
nodig voor polymerisatie. Beschrijven hoe makkelijk je van monomeren een filament maakt.
Bij het plus en min uiteinde is de Cc hetzelfde; de Cc is gerelateerd aan de
thermodynamische aspecten van de vorming het filament/aan de energie van de
verbindingen tussen de subunit en het bestaande filament. De bindingen aan het plus en min
uiteinde zijn hetzelfde, aan het plus uiteinde is Kon en Koff hoog, aan het min uiteinde is Kon
en Koff laag. Groeien en krimpen aan beide zijdes, alleen sneller aan het plus uiteinde.
Nucleatie = de eerste stap van actine monomeren die moeten binden om een oligomeer te
vormen, lag fase. Deze stap verloopt moeizaam. Als het eenmaal gevormd is, gaat
polymerisatie snel. Vormen van filamenten gebeurd in de cel op specifieke plaatsen. Als
ergens in de cel al oligomeren zijn, gebeurd polymerisatie sneller.
Actine is een ATPase. Hydrolyse van ATP
vindt alleen plaats door actine dat al
gepolymeriseerd is. Actine monomeren in
oplossing hydrolyseren ATP niet. Actine
polymeriseert in T vorm, met een vertraging
wordt hier ADP van gemaakt. Actine in D
vorm heeft andere eigenschappen dan actine
in T vorm. In D vorm heeft actine een hoge
Cc (meer monomeren nodig voor
polymerisatie). Aan het plus uiteinde kan nog
een cap zijn van T monomeren, aan het min
uiteinde zijn ze in D vorm. Thermodynamisch
verschil → aan het pluseinde kun je makkelijker monomeren toevoegen, omdat de Cc hier
lager is. Bij een bepaalde concentratie van actine monomeren kan het zijn dat de
concentratie hoog genoeg is voor polymerisatie aan het plus uiteinde maar niet aan het min
uiteinde. Dit fenomeen heet treadmilling → aan het min uiteinde vindt depolymerisatie plaats,
aan het plus uiteinde vindt polymerisatie plaats, het filament verplaatst zich richting het plus
uiteinde.
Microtubuli
Microtubuli zijn dynamisch. Plus uiteindes groeien en krimpen. Geen treadmilling, maar
dynamische instabiliteit. Elke microtubulus kan groeien of krimpen/hier tussen schakelen.
Microtubuli worden opgebouwd uit protofilamenten die bestaan uit dimeren van a-tubuline en
B-tubuline. Tubuline is een GTPase. GTP gebonden aan a-tubuline wordt niet
, gehydrolyseerd, die aan B-tubuline kan
wel hydrolyseren als een a-tubuline er
bovenop aan bindt, dit gebeurd tijdens
polymerisatie. Microtubuli bestaat uit
13 protofilamenten. Plus uiteinde
(de)polymeriseert snel, min uiteinde
(de)polymeriseert langzaam.
Als de subunits net gekoppeld zijn, zijn ze nog in de T vorm, dit vormt een GTP cap. De
aanwezigheid van GTP maakt de microtubuli stabiel. Bij de hydrolyse naar de D vorm
verandert de conformatie en de capaciteit om lateraal te binden. Tubuli dimeren blijven
gebonden in de lengte, maar de individuele protofilamenten buigen naar buiten en vallen uit
elkaar. Als de GTP cap aanwezig is, is de microtubulus stabiel en kan het blijven groeien.
Schakeling tussen groeien en krimpen heet catastrofe. Rescue → van depolymerisatie terug
naar polymerisatie.
Tubuline is een GTPase, hydrolyse van GTP vindt dus plaats, maar dit gebeurd met een
vertraging en nadat a-tubuline er bovenop bindt.
Er zijn stoffen die geproduceerd worden door organismen die het celskelet van dierlijke
cellen beïnvloeden.
Latrunculine bindt actine monomeren en
voorkomt dat ze kunnen koppelen. Geen
filamenten kunnen gevormd worden en
actinefilamenten depolariseren.
Nocodazole heeft hetzelfde effect, maar dan op
microtubuli.
Phalloïdine bindt actine monomeren en
stabiliseert filamenten.
Taxol heeft hetzelfde effect, maar dan op
microtubuli. Stabiele microtubuli, cellen kunnen hierdoor o.a. niet goed delen. Medicatie
tegen kanker om kankercellen minder goed te laten delen.
Polymerisatie is niet afhankelijk van
de energie van ATP/GTP hydrolyse.
Hydrolyse vindt plaats na
polymerisatie. Polymerisatie vindt
plaats door hydrofobe interacties die
spontaan plaatsvinden. Energie van
hydrolyse wordt wel gebruikt voor
depolymerisatie.
, Cytoskelet 2: Regulatie van cytoskelet organisatie en dynamiek
Capaciteit van (de)polymerisatie is afhankelijk van eigenschappen van subunits en regulatie
van de cel. Eiwitten reguleren eigenschappen van filamenten.
Subunit sequestering
Door binding aan monomeren kun
je polymerisatie voorkomen.
Thymosine is een sequestering
eiwit, het bindt aan actine
monomeren en maakt het incapabel
om aan filamenten te binden. Pool
van monomeren die niet
polymeriseren, ook als de Cc laag
is; actine monomeren in de cel zijn
veel aanwezig. Snel op een
bepaalde plek actine filamenten
bouwen, omdat actine concentratie
hoog is.
Profiline bindt aan het plus uiteinde
van een actine subunit, waardoor het met het min uiteinde aan het plus uiteinde van het
filament gekoppeld kan worden. Profiline kan ook aan andere eiwitten binden, waardoor
actine monomeren snel geleverd worden aan het plus uiteinde van het filament. Actine
filament groeit dan snel. Profiline bindt de kant die normaal aan het min uiteinde bindt
waardoor het aan het plus uiteinde moet binden.
Stathmine bindt aan een twee tubuline dimeren. Deze structuur kan geen onderdeel vormen
van een protofilament. Stathmine is belangrijk in zenuwcellen. Deze binding wordt
gereguleerd door fosforylatie, veel fosfaatgroepen zorgen voor het loslaten van stathmine.
Nucleatie
Nucleatie is ook een moment van regulatie. Als er al
een oligofilament aanwezig is op een bepaalde plaats
kan het sneller polymeriseren dan wanneer er nog
nucleatie plaats moet vinden. Actine nucleatie wordt
vaak gereguleerd door een eiwit complex genaamd
Arp 2/3. Arp = actine related protein. Arp eiwitten
lijken op actine en zijn gebonden aan additionele
eiwitten. In de aanwezigheid van een activator eiwit
binden ze aan de zijkant van bestaande
actinefilamenten en starten ze een nieuw filament.
Arp bindt aan de min zijde van een actine complex en
groeit naar de plusuiteinde. Vertakkingen met hoeken
van ongeveer 70 graden. Min uiteinde zijn geblokkeerd.
Ook microtubuli kunnen genucleëerd worden met een speciaal complex: y-tubuline
ringcomplex. Het bestaat uit y-tubuline dat lijkt om B-tubuline en dat een begin maakt van
een nieuwe microtubulus. Daarnaast zitten er speciale extra eiwitten die een ringstructuur
vormen. Op de microtubulus seam worden contacten gemaakt tussen a-tubuline en B-
tubuline, in de rest van de microtubulus zitten alleen alfa naast alfa en beta naast beta. Y-
