BCM21 Week 4
Cristy Verzijl
Enzymkinetiek
Enzymactiviteit
Als maat voor de activiteit van enzymen wordt de snelheid genomen van de
enzymreactie
Enzymactiviteit kan worden uitgedrukt als:
Hoeveelheid substraat die wordt gebruikt per tijdseenheid (vb. nmol/min)
Hoeveelheid enzym in staat om1 μmol substraat per minuut om te zetten bij 25oC
hoeveelheid enzym in staat om1 mol substraat om te zetten per seconde(U of IU,
een niet SIeenheid)
o SI: Système International d’Unités: het internationaal geratificeerde meter‐
kilogram‐seconde systeem voor metingen (wetenschappelijke overeenkomst)
(katal of kat, een SI eenheid), 1 kat = 6 x 107 IU, daarom wordt vaak gebruik
gemaakt van nkat of pkat
Specifieke activiteit (SA) van een enzym
De specifieke activiteit is de activiteit gedefinieerd als het aantal eenheden per mg eiwit
(IU/mg eiwit of katal/kg eiwit)
Spectrofotometische analyse
Reactie A+B↔C+D
Voor bepaling van de enzymactiviteit moet gezocht worden naar een methode om de
verandering van de concentratie van A, B, C of D te kunnen meten in de tijd in
aanwezigheid van een bepaalde hoeveelheid enzym.
Vaak wordt hierbij gebruikt gemaakt van een spectrofotometrische methodeVele
substraten en producten absorberen zichtbaarlicht of UV licht
In de andere gevallen kan gebruik worden gemaakt van een colorimetrische
(kleur) chemische reactie
De verandering in absorbantie bij een bepaalde golflengte als gevolg van de verandering
van de concentratie van de te meten stof kan spectrofotometrisch worden gemeten.
Bepaling van enzymactiviteit
Verscheidene assays zijn gebaseerd op de omzetting van de coenzymen:
NAD+ NADH NADP+ NADPH
Geoxideerde vorm Gereduceerde vorm
Er zijn in principe 2 manieren om de enzymactiviteit te bepalen:
1. Via een continu gemeten reactiesnelheid (direct of indirect)
2. Via een discontinu gemeten reactiesnelheid
1. Via een continu gemeten reactiesnelheid (direct of indirect)
Malaatdehydrogenase (MDH). Voorbeeld van een direct en continu gemeten
reactiesnelheid
malaatdehydrogenase
L-malaat + NAD+ ↔ oxaalacetaat + NADH + H+
Pyruvaatkinase (PK). Voorbeeld van een indirect en continu gemeten reactiesnelheid
Pyruvaatkinase
PEP + ADP ↔ pyruvaat + ATP
Lactaatdehydrogenase
pyruvaat + NADH + H+ ↔ L-lactaat + NAD+
4
, 2. Via een discontinu gemeten reactiesnelheid
Discontinu gemeten reactiesnelheid: De enzymatische reactie wordt na een bepaalde tijd
beëindigd, waarna het reactiemengsel geanalyseerd wordt.
α‐amylase (αA). Voorbeeld van een discontinu gemeten reactiesnelheid
αAmylase
(glucose)n ↔ (glucose)n-1 + D-glucose + H2O
C6H12O6 + 2Cu2+ + 4 OH- → C6H12O7 + Cu2O + 2 H2O
glucose blauw rood
Reducerende suikers, zijn suikers (mono‐ en disacchariden), die een redoxreactie kunnen
aangaan met oxidatoren. Voorbeelden hiervan zijn alle monosacchariden (bijv. glucose,
fructose en galactose) en de disacchariden: lactose en maltose.
Bepaling Enzymactiviteit: kunstmatige substraten
Indien de natuurlijke substraten voor een enzymmatische reactie
spectrofotometrischniettemetenzijndankangebruikgemaaktwordenvakunstmatige
substraten: n
Chromogene substraten: leveren een gekleurd product
Fluorogene substraten: leveren een fluorescerend product
Principe Kunstmatige substraten zijn opgebouwd uit een kernmolecuul
(fluorescerend of gekleurd) gekoppeld aan een andere groep d.m.v. een covalente
band.
Door deze koppeling is het fluorescerende signaal van het kernmolecuul
verlaagd of verandert het gekleurde kernmolecuul in een ongekleurd
kernmolecuul.
Zodra het enzym de covalente band splitst komt het kernmolecuul vrij en
geeft fluorescentie of een gekleurdproduct.
Kunstmatige substraten
Chromogene kernmoleculen (chromoforen)
Nitrofenolen (vb. ortho‐nitrofenyl (ONP))
Nitroanilines
Derivaten van alizarine (vb. TMB)
Indoxylsubstraten (vb. X‐Gluc (5‐bromo‐4‐chloro‐3‐indolyl‐ß‐D‐glucuronide))
Fluorogene kernmoleculen (fluoroforen)
Coumarine derivaten (vb. 4‐methylumbelliferon (MU))
Fluorescein
Bepaling van enzymactiviteit
De wet van Lambert-Beer
A=Ɛ∙l∙c ΔA/Δt = Ɛ ∙ l ∙ Δc/Δt
A = extinctie (‐) = ‐ log (It / I0)
ε = extinctiecoëfficiënt (mL / (mmol∙cm)
l = optische weglengte van de cuvet (cm)
c = concentratie van de absorberende stof (mmol/mL)
4
Cristy Verzijl
Enzymkinetiek
Enzymactiviteit
Als maat voor de activiteit van enzymen wordt de snelheid genomen van de
enzymreactie
Enzymactiviteit kan worden uitgedrukt als:
Hoeveelheid substraat die wordt gebruikt per tijdseenheid (vb. nmol/min)
Hoeveelheid enzym in staat om1 μmol substraat per minuut om te zetten bij 25oC
hoeveelheid enzym in staat om1 mol substraat om te zetten per seconde(U of IU,
een niet SIeenheid)
o SI: Système International d’Unités: het internationaal geratificeerde meter‐
kilogram‐seconde systeem voor metingen (wetenschappelijke overeenkomst)
(katal of kat, een SI eenheid), 1 kat = 6 x 107 IU, daarom wordt vaak gebruik
gemaakt van nkat of pkat
Specifieke activiteit (SA) van een enzym
De specifieke activiteit is de activiteit gedefinieerd als het aantal eenheden per mg eiwit
(IU/mg eiwit of katal/kg eiwit)
Spectrofotometische analyse
Reactie A+B↔C+D
Voor bepaling van de enzymactiviteit moet gezocht worden naar een methode om de
verandering van de concentratie van A, B, C of D te kunnen meten in de tijd in
aanwezigheid van een bepaalde hoeveelheid enzym.
Vaak wordt hierbij gebruikt gemaakt van een spectrofotometrische methodeVele
substraten en producten absorberen zichtbaarlicht of UV licht
In de andere gevallen kan gebruik worden gemaakt van een colorimetrische
(kleur) chemische reactie
De verandering in absorbantie bij een bepaalde golflengte als gevolg van de verandering
van de concentratie van de te meten stof kan spectrofotometrisch worden gemeten.
Bepaling van enzymactiviteit
Verscheidene assays zijn gebaseerd op de omzetting van de coenzymen:
NAD+ NADH NADP+ NADPH
Geoxideerde vorm Gereduceerde vorm
Er zijn in principe 2 manieren om de enzymactiviteit te bepalen:
1. Via een continu gemeten reactiesnelheid (direct of indirect)
2. Via een discontinu gemeten reactiesnelheid
1. Via een continu gemeten reactiesnelheid (direct of indirect)
Malaatdehydrogenase (MDH). Voorbeeld van een direct en continu gemeten
reactiesnelheid
malaatdehydrogenase
L-malaat + NAD+ ↔ oxaalacetaat + NADH + H+
Pyruvaatkinase (PK). Voorbeeld van een indirect en continu gemeten reactiesnelheid
Pyruvaatkinase
PEP + ADP ↔ pyruvaat + ATP
Lactaatdehydrogenase
pyruvaat + NADH + H+ ↔ L-lactaat + NAD+
4
, 2. Via een discontinu gemeten reactiesnelheid
Discontinu gemeten reactiesnelheid: De enzymatische reactie wordt na een bepaalde tijd
beëindigd, waarna het reactiemengsel geanalyseerd wordt.
α‐amylase (αA). Voorbeeld van een discontinu gemeten reactiesnelheid
αAmylase
(glucose)n ↔ (glucose)n-1 + D-glucose + H2O
C6H12O6 + 2Cu2+ + 4 OH- → C6H12O7 + Cu2O + 2 H2O
glucose blauw rood
Reducerende suikers, zijn suikers (mono‐ en disacchariden), die een redoxreactie kunnen
aangaan met oxidatoren. Voorbeelden hiervan zijn alle monosacchariden (bijv. glucose,
fructose en galactose) en de disacchariden: lactose en maltose.
Bepaling Enzymactiviteit: kunstmatige substraten
Indien de natuurlijke substraten voor een enzymmatische reactie
spectrofotometrischniettemetenzijndankangebruikgemaaktwordenvakunstmatige
substraten: n
Chromogene substraten: leveren een gekleurd product
Fluorogene substraten: leveren een fluorescerend product
Principe Kunstmatige substraten zijn opgebouwd uit een kernmolecuul
(fluorescerend of gekleurd) gekoppeld aan een andere groep d.m.v. een covalente
band.
Door deze koppeling is het fluorescerende signaal van het kernmolecuul
verlaagd of verandert het gekleurde kernmolecuul in een ongekleurd
kernmolecuul.
Zodra het enzym de covalente band splitst komt het kernmolecuul vrij en
geeft fluorescentie of een gekleurdproduct.
Kunstmatige substraten
Chromogene kernmoleculen (chromoforen)
Nitrofenolen (vb. ortho‐nitrofenyl (ONP))
Nitroanilines
Derivaten van alizarine (vb. TMB)
Indoxylsubstraten (vb. X‐Gluc (5‐bromo‐4‐chloro‐3‐indolyl‐ß‐D‐glucuronide))
Fluorogene kernmoleculen (fluoroforen)
Coumarine derivaten (vb. 4‐methylumbelliferon (MU))
Fluorescein
Bepaling van enzymactiviteit
De wet van Lambert-Beer
A=Ɛ∙l∙c ΔA/Δt = Ɛ ∙ l ∙ Δc/Δt
A = extinctie (‐) = ‐ log (It / I0)
ε = extinctiecoëfficiënt (mL / (mmol∙cm)
l = optische weglengte van de cuvet (cm)
c = concentratie van de absorberende stof (mmol/mL)
4
