Samenvatting
Summary Expert BLM - course BM10
- Vak
- Expert
- Instelling
- Hogeschool Arnhem En Nijmegen (HAN)
Summary of 14 pages for the course Expert at HAN (Expert BLM cells)
[Meer zien]Voorbeeld 2 van de 14 pagina's
Voorbeeld 2 van de 14 pagina's
In winkelwagengesponsord bericht van onze partner
Verkoper
Volgen
Voorbeeld van de inhoud
ExpertReverse transcription
- Reverse transcriptase Convert RNA to
complementary DNA (cDNA)
- RNA-dependent DNA polymerase
- M-MLV from the Moloney murine leukemia virus
AMV from the avian myeloblastosis virus
- Uses RNA as a primer
- Reverse transcriptase has RNAse activity
- RNAse H activity (by nature)
o Degradation of RNA in RNA:DNA hybrid
o Unwanted for synthesis of long cDNA
o Breaking down RNA molecule
- RNAse activity decreased due to mutations
o Use modified reverse transcriptase in the lab
so it doe not break down the RNA template
Reverse transcription – primers
- mRNA has an poly A tail on the 3’end
- OligodT
o Primer that consist of only T
o Binds to the poly A tail
o Disadvantage: When RNA is degraded the
poly A tail is the first to degrade so the
OligodT can only be used when the RNA is
good
o If youre gene is long not everything is
transcribed, when you do a PCR it can be
that your specific primers bind to the ‘5 and
then nothing can be transcribed
o OligodT are very specific
Only reverse transcribe mRNA
- Random hexamers
o Random sequence of 6 oligomers
o Binds tot he hole gene
o More background (rRNA etc)
o Starts at all positions, also near 5’ end
- Gene specific primers
o Bind to your mRNA
o Only quantify one gene per sample
, Reverse transcription samples
- Normalize RNA input
o 300ng – 1000ng
- Choose oligodT or random hexamers or combination
- Controls
o RT- control
Contamination with gDNA no RT
No reverse transcriptase
o no template negative control (NTC)
Contamination of mixture no
RNA
- In total 8 samples for RT
o 6 RNA samples
o 2 controls
o 500-1000 ng of sample is loaded on the
agarose gel
o Put 1 µg for the cDNA syntheses
Genomic DNA contamination
- rDNAse treatment during RNA isolation
- Genomic DNA contains exons and intron and mRNA only contains exons
- Primers during amplification
o Need a primer that is part of exon 1 and exon 2 to detect only cDNA
E1 and E2 are not close in the genomic DNA so the primers can not bind
to this
o Primes that bind only to Exon 1 or 2
Genomic DNA is large so is not transcribed the hole thing
- qPCR DNA polymerase get a small amount of time
PCR
- Dilute cDNA 10-100x! ~10-50 ng of ‘cDNA’ as input
o Rule of thump: 1ug of RNA = 1ug of cDNA
Nanodrop cannot because in the cDNA master mix there are more pasts
of DNA (Primers enzymes)
o Otherwise the DNA polymerase does not work
- Check annealing temperature
- Reference gene (GAPDH) & gene of interest
- Controls?
o gDNA (no RT)
o No RNA
o PCR master mix (no cDNA template control NTC)
- DNA polymerase needs it own environment
Voordelen van het kopen van samenvattingen bij Stuvia op een rij:
Verzekerd van kwaliteit door reviews
Stuvia-klanten hebben meer dan 700.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet je zeker dat je de beste documenten koopt!
Snel en makkelijk kopen
Je betaalt supersnel en eenmalig met iDeal, creditcard of Stuvia-tegoed voor de samenvatting. Zonder lidmaatschap.
Focus op de essentie
Samenvattingen worden geschreven voor en door anderen. Daarom zijn de samenvattingen altijd betrouwbaar en actueel. Zo kom je snel tot de kern!
Veelgestelde vragen
Wat krijg ik als ik dit document koop?
Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.
Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?
Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.
Van wie koop ik deze samenvatting?
Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper linngeubbels. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.
Zit ik meteen vast aan een abonnement?
Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €5,49. Je zit daarna nergens aan vast.
Is Stuvia te vertrouwen?
4,6 sterren op Google & Trustpilot (+1000 reviews)
Afgelopen 30 dagen zijn er 83430 samenvattingen verkocht
Opgericht in 2010, al 14 jaar dé plek om samenvattingen te kopen