Praktijk theorie Histologie
Les 1:
Macroscopie: grote lijnen, bijv een hele niet, Microscopie: kleine gedeeltes, bijv klein stukje van nier
We moeten weten wat resolutie van lichtmicroscoop, en waarmee kun je het onderscheiden
Fixatie: rottingsproces tegen gaan, alles fixeren
Antigeniciteit: reactiviteit tussen antigen en antilichaam
Is de morfologie goed, is de antigeniciteit slechter en andersom
Paraffine wordt gebruikt voor fixatie, vloeibaar bij 57 graden
Microtoom: om plakjes van weefsel te snijden van 5 mu dun
Bevriezen: milde fixatiemethode
Chemische fixatie: morfologie heel goed meestal met formaline
Kaarsvet mengt niet goed met water en alcohol, met fixatie moet dus eerst al het water er uit.
Dehydratie om water weg te halen. Vervolgens wordt er een intermediaire stof (depar) toegevoegd
wat tussen kaarsvet en water in ligt. Dan infiltratie, tussen 52 en 60 graden. Er wordt dan een
kleuring toegevoegd en inbedding.
Er wordt gebruik gemaakt van PATHOS, histoprocessor: automatische machine die deze stappen voor
ons doen. Vervolgens komt het in een inbed-machine. Het weefsel wordt in een molt gestopt met
parafine.
Huid: overdwars inbedden, dan zie je alle lagen van boven naar beneden. Hier zit dus een orientatie.
Een lever of nier heeft dit niet.
Kleurstoffen zijn altijd waterig, dit betekend dat kleurstoffen in water oplossen. In een coupe moet
dus eerst deparifineren, dan rehydreren met alcohol en kleuren.
Dikte is erg belangrijk. Met 1 mu dun zijn de cellen doorgesneden en veel detail. Met 10 mu dun zie
je geen details, dus coupedikte is belangrijk. Hoe dunner een coupe, hoe hoger de resolutie
Hoe dikker de coupe, hoe hoger de activiteit
Artefacten: kleurfouten
Andere fouten
Kan bijv. plooi in die coupe, of scheur door
krimpen
Aansnijdingseffecten: zie afbeelding
Types microscopen
Lichtmicroscoop (6), fase-contrast microscoop,
elektronenmicroscoop, scanning probe microscoop, fluorescentie microscoop (2) transmissie
elektronenscopie
(5), scanning elektronscopie (1), atomic force (4)
, Lichtmicroscoop maakt gebruikt van witlicht (spectrum van alle kleuren, ultraviolet minste nm en
infrarood meeste nm)
Hoe wordt resolutie omschreven: kleinste afstand tussen 2 punten die nog apart van elkaar kunt
zien. Dus de afstand tussen punten die je in een scheiding kan zien (hoe kleiner R, hoe beter resolutie
(scheidingsvermogen). Formule: 0,61 pi / n sin 0 =
Hoe kleiner de golflengte, hoe kleiner de hoek van breking en hoe beter de resolutie is
Licht wordt verdeeld in een aantal golflengtes. Witlicht wordt gescheiden van UV rond de 200 nm
t/m infrarood (800 nm).
Bijv. druppels water werken als een prisma elke kleur heet een andere brekingsindex en daardoor
krijg je scheiding van licht.
K∗λ
Vergroting ≠ resolutie Berekening resolutie: R =
NA
NA: sinus van de hoek (hoe groter hoe beter de numeriek apparatuur numerical aperture)
DUS hoe kleiner de golflengte (bijv. bij paarse kleur) hoe kleiner R dus afstand tussen 2 punten
die je kunt onderscheiden is ook kleiner hoe meer je ziet
Condensor lens: moet gematched worden met
objectief
Een fluorescentiemicroscoop werkt als volgt: Als eerst
wil je een fluorescente label aan antilichaam
toevoegen en incuberen label moet je aanstralen
(krijgt emissie van licht= uitstraling van nieuw licht).
Wil je een fluorochroom willen waarnemen dan moet
je hem exciteren met een specifieke golflengte. Dit
kan je door d.m.v. een prisma
Fluorescentielicht is dus emissie, en daarvoor moet je
aanstralen met exitatie met hogere golflengte (meer
energie). Groen= 488, rood= 568 en infrarood= 647
(kun je niet zien met blote oog, met sensitieve tool zie
je het als kleur die je zelf wilt dus bijv. blauw). Er wordt
gekozen voor blauw want dit zijn de 3 primaire kleuren=
RGB = wit
Goed voor co-localisatie.
Lage golflengte: UV, veel energie en hoge golflengte: UV,
weinig energie
Hoe zit het met golflengtes en energie? Van UV (korte
golflengte) tot infrarood (lange golflengte). Korte golflengtes hebben minder energie, en straalt dus
meer emissie uit. Van exitatie naar emissie en andersom heeft stokes shift.
Fluorescentie microscopie is absorberen van exitatiegolflengte
waardoor het fluorchroom in een hoger energieniveau komt.
Vervolgens valt het terug, en tijdens het terugvallen zendt het
fluorescentielicht uit (emissie). Als je fluorescentie krijgt zendt je
licht uit, dus verlies je energie. En dan zie je dat de emissie
golflengte langer is dan exitatiegolflengte.
