VOLLEDIGE Samenvatting Methoden in het biomedische onderzoek 2.
Alle info uit de slides en hoorcolleges, van alle hoofdstukken.
Volledig inorde.
Ik studeerde deze samenvatting en had een 17/20.
Alles Methoden 2 (2.1-2.8)
Methoden inleiding (2.1 & 2.2)
Studeren: begrijpen, vergelijken, grootorde van de getallen kennen (g vs mg)
In vitro, ex vivo, in vivo = wet lab
In silico = dry lab
Peer-revieuw = van collega OZ’ers
Laboschrift (gebonden) met controles, resultaten, …
Gedetailleerde beschrijving => republiceren door ander labo
Proefdiermodellen naar klinische studie
Weerlegd: andere resultaten in de mens dan model organisme
Gerepliceerd: positief: zelfde resultaten in mens
Dosis-respons curve: verschillende dosissen toedienen en zien wat er gebeurd
=> slaagkans klinische studie verbeterd
Replicatie: bij zoveel procent is na het opnieuw doen in de mens het juiste resultaat
Genetische evidentie bv. variant in gen zorgt voor ziekte
=> slaagkansen klinische studie verbeterd
Thalidomide: in proefdieren ging het wel: muizen-embryos hebben meer antioxidanten + beschermd
→ belangrijk verschil modelorganisme vs mens
Analyse = meten zoals het is
Modulatie = we gaan iets manipuleren/moduleren: behandelen, kloneren
Precisie:
Detectielimiet: vanaf deze hoeveelheid zie je dat er iets aanwezig is
Kwantificatie: vanaf deze hoeveelheid kan je het ook meten
Specificiteit bv. Coronatest alleen reageren op covid en niet andere antistoffen
,2.3 RNA
Inleiding
DNA vs RNA
- Thymine (stabieler) vs uracil
- Deoxyribose: Geen 2’OH vs ribose: 2’OH
=> 2’OH vatbaar voor afbraak door RNAsen
DUS DNA stabieler dan RNA => makkelijk modificaties
- Ds vs ss
- RNA kan secundaire/tertiaire structuur hebben + korter dan DNA
(ddNTPs bij Sanger sequencing => ook geen 3’OH => geen ketenverlenging (fosfodiesterbinding))
Soorten RNA
tRNA => TLN naar eiwitten I mRNA = boodschap voor TLN
rRNA (95%) => veel aanwezig DUS voor kwaliteitscontrole (zie verder) Coderend RNA
lncRNA = lang (>200 nt) I siRNA = kort => moduleren cellen
miRNA = kort (<200 nt) => reguleren TXN (genexpressie) Niet coderend RNA
mRNA
DNA → pre-mRNA → mRNA (matuur) → polypeptide
Splicing = verwijderen intrionen
TXN splicing TLN
mRNA: 5’cap + 5’UTR + 3’UTR + polyA => niet naar eiwit
5’cap en polyA niet gecodeerd maar post-transcriptie toegevoegd
Voorzorgen en bewaren voor problemen
Modificatie RNA in staal (RNA instabiel <>DNA)
= Degradatie (dmv endogene/exogene bv.RNAse) + inductie genen
- Anticoagulans EDTA bij staalname <> heparine (inhibeert RNA reactie)
RNA stabilisatie => langer bewaren
snel werk, inviezen (vloeib. N2),
RNA bewaarmiddel => langer bewaren bij Tkamer
→ bij bloed (bv.PAXgene tube)/ bij cellen bv. Trizol (1e stap extractie) of
RNAlater (voor extractie): (NH₄)₂SO₄ -opl. => neerslag eiwitten (RNAse = eiwit)
RNAse vrij werk
labojas, handschoenen, RNAse schoonmaakproduct,
buffer/water bewerken met RNAse inhibitor => nuclease-vrij
bv. DEPC (carcinogeen): reactie amines van AZ in katalytic site(!niet in Trisbuffer: Tris= amine)
,Bewaring RNA
In RNAse vrij water/ TE buffer (EDTA inhib. enkel DNAsen), op -80°C (1jaar <DNA),
als alcoholprecipitaat,, meerdere aliquots in RNA bewaarmiddel => later RNA extractie
DNA contaminatie bij RNA extractie
(!moeilijker DNA verwijderen van RNA dan RNA van DNA)
- Niet altijd probleem
- Detectie via electroforese of RTmin controle
DNAse behandeling ALS contaminatie WANT ook verlies/degradatie RNA
= DNAse(l) tijdens/na extractie RNA => knip DNA + hitte inactivatie/ verwijderen DNAse
RNA extractie
! vgl met DNA extractie
1)Lysis van staal = kapot maken cellen
= breken cellen (RNA vrij) => °lysaat/ homogenaat = vl. met inhoud cellen (afh. startmateriaal en
doel)
- Toep. lyseren: In extractie van DNA (Hfdst 1.13), RNA (Hfdst 2.3), eiwitten (Hfdst 2.4)
Vaak toevoeging remmers van niet-gewenste moleculen, bv DNasen, RNAasen, proteasen,…
Methoden voor lysisch (afh. weefsel, celtype, V, …):
• Detergent toev. (meestal) bv. SDS, Trizol (guanidium thiocyanaat), guanidium chloride..=> lysis
• Vriezen en ontdooien (snel) => lyseren (kapot maken) cellen
( <> cryopreservatie (=traag) om cellen intact/leefbaar te houden: HT1.3)
• Mechanische homogenisatie:
o Pletten in mortier met pestel (in vloeibare stikstof)
o Bead-gebaseerde homogenisator:
beads (= kralen) in buis met cellen + schudden => °homogenaat
• Vloeibare homogenisatie: dounce homogenisator/ douncer:
oplossing tussen glazen pestels => bewegen => vloeistofstroom => lyseren cellen
Positief: milder: organellen intact (<> mechanische)
• Sonicatie (geluidsgolven) => OOK DNA/ RNA fragmenteren (bv. bij Sanger: DNA frag nodig)
, 2) Isoleren/extractie RNA
= RNA uit lysaat opzuiveren (geen eiwitten, DNA,…)
dmv organisch solvent, alcoholprecipitatie of
kolomchromatografie
Vergelijk DNA: fenol – chloroform voor extractie DNA (pH=7 <> Trizol = zuur)
RNA (negatief Q: polair) altijd in H20 laag
<> DNA in H20 of organische/ interlaag afh. van pH (negatief Q/neutr.)
Alcoholprecipitatie supernatans (precipitatie = neerslag)
= idem DNA
DNA & RNA (P03-) neerslag bij toevoegen zout (bv Na+, Na-acetaat) + alcohol (ethanol, isopropanol)
=> Neg. DNA neutr. door Na+ (=hydrofoob)+ alcohol => neerslag uit opl. => °vlokje
(bij lage conc.: lagere temp. Of drager (glycogeen) toev. => beter zichtbaar)
=> RNA/DNA pellet oplossen in water/buffer
1e organisch/kolom => DNA/RNA dan precipitatie => neerslag DNA/RNA
→ DNA extractie: RNAsen toev => enkel DNA
→ RNA extractie (moeilijker) : 1e test of contaminatie DNA, 2e DNAsen (want RNA verlies)
Kolomchromatografie
1e RNA (/DNA) bindt selectief silica kolom dmv zout + pH condities => rest loopt door (!DNA niet
100%)
2e Elutie RNA door ∆condities
Opstelling: lysaat in kolom (silica/anionenuitwiss.) => vloeistof door kolom (dmv centrif., Fz of
vacuüm)
Pos: eenvoudig, zeer goede zuiverheid
Neg: duurder (aankopen), capaciteit kolom (kan maar beetje RNA binden)=> opbrengst beperkt
Silica kolom
= idem DNA <>bij DNA ook nog anionenuitwisselaar (+ Q)
• Buffer met chaotrope zouten (bv. quandidium Cl) (all-in one)
=> lysis, inhiberen nuclease, selectieve binding RNA aan silica kolom
• = Spin kolom: vloeistof door kolom dmv centrifugatie (eiwitten, .. verwijderen)
• Vrijzetten/ elutie RNA via water/buffer
Automatisering: voor grote schaal bv. Covid-19 test (RNA)
Magnetische silica beads => RNA/DNA bindt => magneet: beads uit opl. => ∆conditie => RNA vrij
Kwantificeren RNA
≈ DNA (onderlijn = verschil)
Voordelen van het kopen van samenvattingen bij Stuvia op een rij:
Verzekerd van kwaliteit door reviews
Stuvia-klanten hebben meer dan 700.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet je zeker dat je de beste documenten koopt!
Snel en makkelijk kopen
Je betaalt supersnel en eenmalig met iDeal, creditcard of Stuvia-tegoed voor de samenvatting. Zonder lidmaatschap.
Focus op de essentie
Samenvattingen worden geschreven voor en door anderen. Daarom zijn de samenvattingen altijd betrouwbaar en actueel. Zo kom je snel tot de kern!
Veelgestelde vragen
Wat krijg ik als ik dit document koop?
Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.
Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?
Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.
Van wie koop ik deze samenvatting?
Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper paulinebal. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.
Zit ik meteen vast aan een abonnement?
Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €12,99. Je zit daarna nergens aan vast.
