Moleculaire celbiologie, samenvatting tussentoets stof
(H1, 4, 5, 6, 7, 12, 13)
DNA is opgebouwd uit nucleïnezuren, de helix is dubbelstrengs (veroorzaakt
door waterstof bruggen) en antiparallel, biosynthese verloopt van 5’ naar 3’
(door phosphodi-esters)
Het DNA in eukaryotencellen ligt in hoge mate geordend (betere controle
genexpressie en activatie/de-activatie van chromatine gedeelten) terwijl dit bij
prokaryoten niet het geval is (nauwelijks transcriptie
controle)
De organisatie van het DNA in eukaryoten bepaald controle
genregulatie
Chromosomen zijn typerend voor eukaryoten (hoog
geordende chromatine)
Chromatine: complex van DNA (die in een dubbele helix
gewonden zit om vele nucleosomen) en eiwitten in de
celkern. Chromatine zorgt voor de compactheid van het
DNA zodat het in de celkern past, daarnaast helpt het ook
bij de regulatie van de expressie van genen
Nucleosoom: bestaat uit 8 histonen H2A en H2B (2
dimeren binden aan tetrameer), H3 en H4 (vormen een dimeer, vervolgens
vormen 2 dimeren een tetrameer). De histonen hebben iedereen een N terminale
staart die naar buiten steekt, de rest van het histon ligt erg compact opgeborgen
Nucleosomen zijn dynamisch (DNA kan ontvouwen van de
histonen) en worden hierbij geholpen door enzymen (ATP-
dependent chromatin remodeling complex). Histonen kunnen
verwisseld worden tijdens remodeling van DNA.
H3: gemodificeerde vorm zorgt voor de locatie van het
centromeer
Epigenetica: wetenschap die zich bezighoudt met
overervingen die niet veroorzaakt worden door
veranderingen in de nucleotide sequentie maar door
veranderingen in gen-regulerende eiwitten of erfelijke
modificaties van histon eiwitten of het DNA. Beide vormen
hebben invloed op de genepressie omdat zij het DNA minder
of meer toegankelijk maken voor transcriptie factoren.
,Bij de genetische variant kan het gen worden uitgeschakeld. Bij de epigenetische
variant kan er niks met het gen gebeuren zolang het DNA gebonden zit om de
histonen. Zodra de eiwitten eraf zijn kan het gen wordt aan gezet.
Bij de ontwikkeling van een embryo wordt heterochromatine gevormd dat zich
verspreid over de euchromatine stukken (barrière tussen euchromatine en
heterochromatine vervalt) in verschillende mate in verschillende cellen (gene
silencing bijv. gen 1 en 2 op het euchromatine stuk worden omgezet tot
heterochromatine waardoor deze genen inactief worden)
Heterochromatine: compact DNA waardoor genen inactief zijn
Euchromatine: losser DNA waardoor genen actief zijn
De grens tussen deze 2 vormen staat niet vast kan gedurende de ontwikkeling
verschuiven
Biochemische modificaties van aminozuren van histonen (vinden meestal plaats
op de uiteinden)
- Methylering (CH3 groep toevoegen aan lysine): competerende reactie met
acetylering die ervoor zorgt dat transcriptie niet meer mogelijk is omdat het
aminozuur beter bindt aan het DNA
- Acetylering (CH3-CO- groep toevoegen aan lysine): zorgt ervoor dat het
aminozuur minder positief geladen wordt waardoor het slechter bindt aan het
DNA en dus beter bereikbaar is voor transcriptiefactoren. De transcriptie zal
verhoogd worden.
- Phosphorylering (fosfaatgroep toevoegen op reactieve OH plaats aan serine,
threonine, tyrosine
- Ubiquitilation
Het lezen van een histon code wordt gedaan door een code-reader complex
De verspreiding van chromatine modificaties gebeurd door middel van een
kettingreactie met een reader-writer complex. Gene regulatory protein zet
een writer op een histon, vervolgens leest een reader wat de writer heeft
veranderd aan het histon en zet een nieuwe writer op het naastgelegen histon
die vervolgens de zelfde verandering doorgeeft aan dat histon.
Wanneer chromatine een uitstekende loop heeft betekend dit dat deze loop
toegankelijk is voor gen expressie
,Aan de buitenkant van de nucleus zit voornamelijk heterochromatine (niet
actief). Wanneer het actief wil worden en dus euchromatine wordt trekt het naar
het middelpunt van de nucleus
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------
---------------------
2. Genoom en DNA transcriptie
Processen die resulteren in de verandering van het genoom: deletie, duplicatie
kan gen in-activatie (een gen is actief het andere gen wordt een pseudogen) en
gen diversificatie veroorzaken (beide genen zijn actief maar in verschillende
weefsels en verschillende ontwikkelingsstadia), inversie, transpositie
Duplicatie van exonen zorgt voor multidomein eiwitten
Sequenties van coderende stukken DNA veranderen nauwelijks door purifying
selection
Phylogenetic tree: een vertakte diagram die evolutionaire relaties laat zien
tussen verschillende soorten gebaseerd op overeenkomsten en verschillen
tussen physical en genetische karakteristieken (muis en mens hebben zelfde
hoeveelheid genen en er is sprake van homologie tussen exonen)
3 stappen tijdens replicatie die zorgen dat er goed DNA gemaakt wordt
- 5’ 3’ polymerization (complementair DNA maken (coderende streng) in
tegenovergestelde richting aan de template streng met DNA polymerase).
Wanneer er bijv. een tautomerische C bindt met een A wordt deze verwijderd
omdat als hij omgezet wordt naar een normale C hij niet past op A. Exonuclease
(dat op DNA polymerase zit) zorgt ervoor dat er aan het 3’ weer een OH groep
komt zodat de streng maak voort kan zetten
- 3’ 5’ exonucleolytic proofreading
- Strand directed mismatch repair: wanneer er een fout zit in de nieuwe DNA
streng die gemaakt is, binden mismatch proofreading proteins (MutS en
MutL) aan die nieuwe streng en herkennen een kink in de streng, knipt het foute
stuk DNA vervolgens uit de streng en zorgt dat er DNA synthesis van goed DNA
optreed (herstelt 99% van de replicatiefouten)
Helicases zorgen voor het ontwinden van dubbelstrengs DNA (kost ATP)
Clamp eiwitten zorgen ervoor dat DNA polymerase op het DNA blijft zitten
DNA topoisomerases houden DNA uit de knoop wanneer het ontwonden is
- Topoisomerase I met tyrosine in de actieve site, bindt covalent aan een
fosfaatgroep op het DNA waardoor een phosphodi-ester breekt en vervolgens
een van de DNA strengen. Hierdoor kunnen de 2 DNA strengen vrij draaien. De
,energie die aanwezig was in de phosphodi-ester binding wordt opgeslagen in de
phospotyrosine binding waardoor het proces reversibel is
- Topoisomerase II zorgt ervoor dat 2 circulaire dsDNA die in de knoop zitten weer
in originele staat terugkeren (zonder knoop)
Replicatie van het DNA vindt niet overal tegelijkertijd plaats tijdens de S-fase
Tijdens replicatie wordt het uiteinde van de streng vaak niet gerepliceerd, dit zou
betekenen dat de streng die gerepliceerd moet worden steeds korter wordt en je
uiteindelijk geen streng overhoud. Telomerases lost dit probleem op (gebaseerd
op reverse transcriptase: van RNA maak je DNA) en herstelt het
chromosoomuiteinde (telomeer) door een stuk aan de streng te zetten na de
deling (hierdoor blijft de streng dus dezelfde lengte behouden).
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------
---------------------
3. DNA repair, homologe recombinatie, transposons, translatie
DNA schade kan ontstaan door spontane hydrolyse, reactieve radicalen door
oxidatieve fosforylering, of door stralingsschade (UV)
Depurinering (door middel van een hydrolyse reactie ontstaat en guanine of
adenine en een suiker fosfaat groep) en deaminering (hydrolyse reactie van
cytosine in uracil waarbij NH3 vrijkomt) van cytosine. Door beide van deze
processen treden mutaties op. Door depurinering wordt vaak een base-paar
verwijderd en door deaminering wordt er een verkeerde base ingebouwd.
, DNA reparatie methodes enkelstrengse
breuken
- Base excision repair: foute basen worden herkend door een flipping out
mechanisme. Wanneer een foute base wordt herkend wordt deze door middel
van DNA glycosylase verwijderd waardoor er een base mist in de streng.
Endonuclease en phosphodi-esterase verwijderen vervolgens de suiker-fosfaat
groep. DNA zorgt voor een nieuwe base die wel past en ligase zorgt ervoor dat
de streng weer hersteld wordt
- Nucleotide excision repair: verstoring van de normale lineaire DNA structuur
wordt herkent. Werkt hetzelfde
als je base excision repair. Nu
wordt er alleen niet een base
uitgeknipt maar een heel deel
van de streng die vervolgens
herstelt moet worden.
Door deaminering van adenine ontstaat hypoxanthine, uit cytosine ontstaat
uracil, en uit guanine ontstaan xanthine. Thymine kan niet gedeamineerd
worden.
,DNA reparatie mechanisme voor dubbelstrengse
breuken
- Non-homologe: stuk van de streng waar de
breuk zit wordt compleet verwijderd en
vervolgens worden gelijke uiteinde weer aan
elkaar geplakt.
- Homologe recombinatie: stuk waar de breuk
zit wordt compleet verwijderd en vervolgens
wordt aan de hand van de complementaire
streng een nieuw stuk DNA gevormd
Reparatie van de replicatie
vork
RecA (rad51) katalyseert DNA
synapses
DNA helicasen katalyseren branch
migration
?????????????????????????????
,Reparatie van een breuk in dsDNA door
homologe recombinatie
????????????????????????????
Homologe recombinatie is sterk gereguleerd.
Wanneer er te weinig homologe recombinatie
optreedt zal er ophoping van DNA schade zijn.
Wanneer er teveel uitwisseling plaatsvindt tussen
homologe chromosomen zal heterozygositeit
verloren gaan.
Homologe recombinatie tijdens meiose
Vormen van DNA recombinatie:
- Homologe recombinatie: sequenties moeten sterk homoloog zijn, uitwisseling
tussen chromosomen maar volgorde van genen blijft in stand
- Transpositie/conservatieve specifieke integratie: homologie niet vereist,
mobiele genetische elementen (jumping genes)
Transpositions
- DNA-only transposons: cut and paste mechanisme. Stukje DNA dat zichzelf
kan kopiëren en op een andere plaats in het DNA kan inbouwen (links)
, - Retroviral-like
retrotransposons: gaat hetzelfde
als bij een virus. Gebaseerd op reverse transcriptase. Van een stukje RNA wordt
DNA gemaakt, vervolgens wordt dat DNA verdubbeld zodat je dsDNA hebt. Dat
kan ingebouwd worden en daar kan weer RNA van gemaakt worden en
vervolgens nieuwe eiwitten wat nieuwe virusdeeltjes zijn (rechts)
- Nonretroviral retrotansposons
Conservatieve specifieke integratie: belangrijk om genen aan of uit te
schakelen
Verschillen DNA en RNA
- DNA bevat deoxyribose en RNA bevat ribose, DNA is dubbelstrengs en RNA is
enkelstrengs, DNA bevat base thymine (T) en RNA bevat base uracil (U)
