Immunology Research and Clinic
Summary – Lectures
Door: Bonifiya Visuvasam
1
, Lecture 1
Immunological interactions and B cell research
Innate immune response
• Infection starts with inflammation, which ultimately leads to induction of a specific immune
response by B- and T cells:
o See figure: phagocytosis of bacteria → bacteria trigger macrophages to release
cytokines and chemokines → vasodilation (verwijding van bloedvaten) and increased
vascular permeability cause redness, heat, and swelling at infection site →
inflammatory cells migrate into tissue, releasing inflammatory mediators that cause
pain.
o Infection → phagocytosis by macrophages → cytokines and chemokines →
inflammation: influx of plasma, neutrophils and monocytes → increased inflammatory
reaction → increased lymph drainage to lymph nodes + activation of antigen
presenting cells (APCs) → induction specific immune response by APCs → influx of
antibodies and T cells to site of infection.
• Dendritic cells = DCs of the innate immune system are the most important APCs, that are
involved in inducing specific immune response against an infection.
• Induction of the specific immune response (see figure): activation of DCs = APCs because of
antigen recognition at peripheral infection → active DCs + antigen enter lymph vessels → DCs
& antigen migrate to lymph nodes → DCs induce activation + maturation of CD8+ and/or
CD4+ T cells / antigen induces activation + maturation of naïve B cells → Tact + Bact (active) cells
formed in lymph nodes → migration to periphery → CD8+ Teffector cells (= cytotoxic T cells) &
plasma cells (excrete antibodies) act at periphery, and their activity is regulated by CD4+
Teffector cells.
• Dendritische cellen van het aangeboren immuunsysteem zijn belangrijke APCs die het
specifieke immuunsysteem aanzetten (zie figuur):
o Immature DC neemt antigenen op.
o DC activeert raakt geactiveerd doordat het PAMPs (= pathogen-associated molecular
patterns) van het pathogeen herkent met specifieke TLRs genaamd PRRs (pattern
recognition receptors) → deze receptoren maken onderscheid tussen ‘self’ en ‘non-
self’.
o Geactiveerde DC migreert via lymfevaten naar de lymfeknoop.
o Mature DC zet specifieke immuunrespons in de lymfeknoop.
o DC matureert na activatie tijdens de migratie richting de lymfeknoop (zie figuur).
• Dendritische cellen van het aangeboren immuunsysteem zetten dus het specifieke
immuunsysteem aan! (zie figuur).
• Functies van DCs: migration, antigen presentation, costimulation → deze functies zijn nodig
voor het induceren van naïve T cell priming.
2
,TLR activation by PAMPs induce innate and adaptive responses
• Activatie van DCs met behulp van TLR activation = PRR activation door PAMPs induceert
adaptive response (aangezien er uiteindelijk cellen van adaptive immune system geactiveerd
raken door de DCs).
• Activatie van macrofagen met behulp van TLR activation = PRR activation door PAMPs
induceert innate response (aangezien deze manier van macrofaag activatie uiteindelijk
resulteert in inflammatie door release van cytokines/chemokines).
o
Acquired T cell response
• De lymfeknoop bevat vooral B-cellen in de primaire lymfoïd follikel, en vooral T-cellen in de
paracorticale regio in de cortex (zie figuur voor de volledige structuur van een lymfeknoop).
o T-cellen kunnen doormiddel van antigeen-presentatie geactiveerd worden met
behulp van de lymfeknoop.
• T-cel activatie en de lymfeknoop (zie figuur voor overzicht):
o The fate of the T cell in the lymph node depends on antigen recognition
o T-cellen komen in de cortex van de lymfeknoop doormiddel van speciale bloedvaatjes:
high endothelial venules (HEVs).
o Sommige T-cellen worden vervolgens geactiveerd door antigeenpresentatie van
mature DCs in de cortex, omdat ze het specifieke antigeen herkennen!
o Niet-geactiveerde T-cellen verlaten de lymfeknoop via de corticale sinussen.
o Geactiveerde T-cellen (antigeenpresentatie) prolifereren en verliezen de mogelijkheid
om de lymfeknoop te verlaten.
o Geactiveerde T-cellen differentiëren tot effector T-cellen en verlaten de lymfeknoop
→ geactiveerde antigeen-specifieke T-cellen blijven enkele dagen in de lymfeknoop
totdat ze volledig geprolifereert + gedifferentieerd zijn tot effector T-cellen = klonale
expansie: proliferatie en differentiatie van geactiveerde specifieke lymfocyten om een
kloon/familie van effector cellen te creëren, die een specifiek antigeen herkennen (zie
figuur).
• Immunologische synaps: wordt gevormd tussen een T-cel en een APC → is nodig voor het
induceren van activatie + differentiatie van de T-cel door de APC (see figure).
o Immunological synaps contains different domains:
▪ cSMAC = central supramolecular activation cluster
▪ pSMAC = peripheral supramolecular activation cluster
• TLR activation of APC gives rise to 4 signals for T cell responses (see figure): voor een goede T-
cel priming zijn deze 4 signalen van de APC (DC) nodig;
1. TCR/MHCpeptide complex
2. Costimulation
3. Cytokines
4. Induction homing
3
, o Zie figuur voor overzicht van 4 signalen: in de figuur wordt door de DC een pathogeen
opgenomen na herkenning van PAMPs + activatie van/door TLR. Het pathogeen wordt
afgebroken tot antigeen (peptides) die vervolgens gepresenteerd worden op een
MHC-II molecuul. MHC-II:antigeen complexen worden altijd herkend door de TCR van
een naïeve CD4+ T-cel, zoals het figuur ook weergeeft. De signalering tussen de TCR
en het MHC-II:antigeen complex (signaal 1), wordt gevolgd door signaal 2: co-
stimulatie door CD80/CD86 (zie figuur). Vervolgens worden cytokines geproduceerd
(signaal 3) door de DC voor differentiatie van de naïeve CD4+ T-cel in één van de
soorten effector CD4+ Th-cellen. Ten slotte wordt de homing gesignaleerd door de
DC, waardoor de gevormde effector CD4+ Th-cel kan migreren naar de infectie-sites
waar de cel nodig is (signaal 4).
o Wanneer een MHC-I:antigeen complex gepresenteerd wordt voor een signaal 1, zal
dit herkend worden door de TCR van een naïeve CD8+ T-cel! Verder verlopen de
signalen 2/3/4 hetzelfde als hierboven beschreven.
• Effector T cells: cytotoxic T cells (CTLs) and Thelper cells (TH) → see figure!
o Cytotoxische T-cellen (CTLs) ontstaan na activatie van CD8+ naïeve T-cellen door een
MHC klasse I:peptide complex. De cellen doden virus-geïnfecteerde cellen door
apoptose te induceren.
o Th-cellen ontstaan na activatie van CD4+ naïeve T-cellen door een MHC klasse
II:peptide complex. De cellen helpen/reguleren de werking van andere immuun cellen
zoals macrofagen, eosinofielen, mestcellen, basofielen, neutrofielen, B-cellen. Treg
(regulatoire T-cellen) inhiberen dendritische cellen, en daarmee indirect de T-cel
activatie (zie figuur).
• Distinct PRRs of APCs regulate pathogen-class specific CD4+ Th differentiation: see figures.
o Th1 cells: regulate killing bacteria, tumor → IL-12 production by APC triggers
differentiation of naïve CD4+ in Th1.
o Th2: regulate killing parasites
o TFH: help in antibody production
o Th17: regulate neutrophil activation, killing fungi/bacteria → TGF-β, IL-1 and IL-6
production by APC triggers differentiation of naïve CD4+ in Th17.
o DCs induce regulatory Thelper cells = Treg in absence of PRR activation = no TLR →
Treg: downregulation/tolerance → TGF-β or IL-10 + low costimulation triggers
differentiation of naïve CD4+ in Treg.
Acquired B cell response
Ook B-cellen differentiëren in de lymfoïde organen zoals T -cellen, echter gebeurt dit bij het
tegenkomen van een antigeen (zie figuur):
• Naïeve B-cellen komen de lymfeknoop binnen via de bloedvaten en verlaten de lymfeknoop
via het efferente lymfevat.
• B-cellen die in de (primaire lymfoïde) follikel liggen en hier antigeen herkennen met hun
specifieke BCR vormen een primaire focus (zie figuur). Sommige prolifererende B-cellen
4
, afkomstig van een HEV migreren naar het follikel en vormen samen met de primaire focus
een germinal center (kiemcentrum).
• In het germinal center prolifereren en differentiëren de naïeve B-cellen tot plasmacellen. De
plasmacellen migreren vervolgens naar de medullary cords / verlaten de lymfeknoop
efferente lymfevaten.
• Plasmacellen migreren vervolgens richting het rode beenmerg & gaan hier antistoffen
produceren.
• B-cellen zorgen voor antistofvorming (zie figuur): een naïeve B-cel differentieert na activatie
tot een plasmacel, die antistoffen produceert. De uitgescheiden antistoffen zijn eigenlijk de
oplosbare vorm van de bijbehorende BCR op de oorspronkelijke B-cel. De antistof heeft dus
dezelfde specificiteit als de antigeen-herkennende BCR! Antistoffen hebben na uitscheiding 3
verschillende effectorfuncties (zie figuur):
o Neutralisatie: antistof bind de bacterie of de uitgescheiden bacteriële toxin →
geneutraliseerde bacteriën/toxins gefagocyteerd door macrofaag.
o Opsonisatie: antistof bindt aan extracellulaire bacterie en dit complex wordt
vervolgens aan molecuul op macrofaag gebonden voor fagocytose.
o Complement activatie: antistof bindt aan bacteriën in plasma, vervolgens wordt een
complement geactiveerd, en vindt er lysis en ingestion plaats.
• B cell differentiation and B cell effector function: see figure for overview.
1. Generation of B-cell receptors in the bone marrow: B-cell precursor in bone marrow
rearranges its immunoglobulin genes → this process is regulated by cytokines excreted by
bone marrow stromal cell.
2. Negative selection in the bone marrow: immature B cell that recognize and bind to self
cell-surface antigen are autoreactive and therefore removed from the repertoire.
3. Migration of B cells through the circulatory system to lymphoid organs and B-cell
activation: mature B cell bound to 3D/multivalent foreign antigen is activated.
4. Antibody secretion and memory cells in bone marrow and lymphoid tissue: activated B
cells give rise to plasma cells and memory cells.
• Antibody is secreted form of the BCR!
• B-cell recognizes multivalent foreign antigen, T-cell recognizes MHC-antigen complex, cells of
innate immune system recognize PAMPs with PRRs = TLRs.
• B cell receptor = BCR complex consists of mIg and Igα/Igβ: see figure.
o 2 light chains, 2 heavy chains → ends of chains for recognition of antigen.
o mIg = membrane-bound immunoglobulin → recognizes specific antigen
o Igα/Igβ initiate cell signaling upon/after crosslinking of mIg by specific antigen
• B cell activation, survival and proliferation requires 2 signals: see figure.
o Thymus-dependent antigen: multivalent antigen recognition by B cell + TFH help.
o Thymus-independent antigen: polyvalent antigen recognition by B cell + LPS
recognition by TLR on B cell.
• Functions of IgM: pentameric antibody: 5 complexes bound together through J chain.
o What makes IgM different compared to other antibodies? → produced immediately,
low affinity, penta/hexamer, does not need T cell help or GC reaction.
5
, o What is the use of the penta/hexameric structure of IgM? → IgM does not need
somatic hypermutation and affinity maturation. Therefore it has a low affinity.
Multimeric structure generates high avidity.
• Thymus-dependent = T cell dependent B cells differentiate in the lymphoid organs:
o Zie pagina 4-5 voor toelichting van figuur.
o Verloop van T-cel dependent antibody response: zie figuren.
1. BCR van B cell herkent antigen = signaal 1 → activatie B-cel leidt tot upregulation
van CD40.
2. APC in periferie herkent PAMP van antigen met PPR=TLR in periferie, migreert
richting lymfeknoop, en presenteert op MHC-II-antigen complex aan naïeve CD4+
T-cel → activatie & differentiatie van naïeve CD4+ T-cel → vorming van specifieke
CD4+ effector T cel die CD40L tot expressie brengt.
3. Bij de rand tussen de B- en T cel zone zal actieve CD4+ effector T-cel met de
specifieke TCR de B cel scannen en kijken of het antigen gepresenteerd wordt
waar de T cel specifiek voor is → als dit het geval is, zal de T-cel antigen
herkennen die wordt gepresenteerd op MHC-II door actieve B-cel die CD40 tot
expressie brengt → CD40 B-cel en CD40L van CD4+ T cel associëren = signaal 2 →
CD4+ effector T cel zal de B-cel helpen na deze associatie/herkenning → signaal 2
= CD40/CD40L = anti apoptotic signal = co-stimulation → proliferatie B cel.
4. Signaal 3: CD4+ effector T cel zal cytokines productie & excretie → class switching
of IgM to IgG/IgE, somatic hypermutation and affinity maturation.
5. Formation of plasma cells & memory cells → antibody production → elimination
of pathogens
o Thus specific CD4+ effector T cell (TFH!) provides B cell anti-apoptotic signal for
proliferation and cytokines for differentiation & maturation = help for antibody
production!
o E.g.: Primary B cells take up Salmonella and activate CD4 T cells and induce T cell-
dependent IgM and IgG
• Follicular Thelper cells = TFH are key in providing B cell help → thus are the specific CD4+
effector T cells formed in T cell dependent / thymus dependent B cell activation/maturation
that is described above ! → TFH provides help in antibody production by B cells!
• See figure: Tfhs are required for GC-reaction (germinal center) and therefore needed for long-
lived humoral immunity → TFH formed after activation of naïve CD4+ T cell by antigen-
presenting DC (APC) in T cell zone → These TFH cells express a chemokine receptor to attract
6
, them to the B-T zone border → B cell in B cell zone gets activated by antigen that comes into
B cell zone in lymph node by migration through lymph vessels → antigen recognized by B cell
→ active B cell → B cell takes up antigen, destructs it & presents on MHC-II to signal for help
from TFH → TFH meets active B cell for scanning at border of B- and T cell zone to see whether
it can help this B cell (does is present the antigen that the T cell is specific for?) →
immunological synapse formed when recognition takes place → B cell proliferation induced by
co-stimulation = CD40/CD40L & differentiation induced by cytokines excreted by TFH →
formation of short-lived plasma cells (see figure)
• TFH can also be enter the germinal center in the B cell zone and become GC TFH and help B
cells by inducing formation of memory B cells + short-lived & long-lived plasma cells (see
figure).
• T-cell dependent B cell differentiation occurs in GC reactions → T-cel afhankelijke B-cel
differentiatie gebeurt dus in de GCs (zie figuur) →Uiteindelijk wil je B-cellen met een hogere
affiniteit → affiniteitsrijping:
o Een B-cel herkent en bindt een zelf antigeen in de GC light zone, of herkent een
antigeen gepresenteerd op MHC-II door een FDC (follikel dendritische cel) → B-cel
neemt antigeen op, breekt het af, en presenteert het op MHC-II voor herkenning door
Th cel → raakt geactiveerd door signaal 1 + brengt chemokine receptor tot expressie
om naar grensgebied te gaan.
o Bij de grens van de T- en B-zone vindt het eerste contact plaats tussen de effector Th-
cel en de naïeve B-cel → TCR checkt of B-cel juiste peptide aanbied op MHC-II.
o De B-cel raakt geactiveerd door co-stimulatie (CD40) en cytokines van de Th-cel.
o B-cel gaat in eerste instantie prolifereren, somatische hypermutatie ondergaan
(hogere affiniteit), en isotype (klasse) switch ondergaan (voor juiste functionele
antistof) in de GC dark zone terug in follikel (verlies chemokinereceptoren).
o Vervolgens wordt de affiniteit van de BCR voor het antigeen gecheckt in de GC light
zone doordat de B-cel zelf antigeen herkent en bindt of een FDC (follikel dendritische
cel) opnieuw antigeen presenteert op MHC-II.
o Er vindt een selectieproces plaats om te kijken of de affiniteit goed genoeg is (FDC
doet dit). Kan het beter? Dan mag de B-cel een aantal keer opnieuw gaan de cyclus in
door signaal 2 en 3 van TFH-cellen te krijgen voor prolifereren/somatische
hypermutatie/klasse-switch, totdat er een B-cel met hoog-affine BCR is ontstaan voor
het antigeen → vervolgens neemt de B-cel opnieuw antigeen op, breekt het af,
presenteert op MHC-II om hulp van TFH-cel te krijgen → TFH-cel zorgt ook voor
cytokines en co-stimulatie van B-cel, en vervolgens kan de B-cel prolifereren +
differentiëren tot plasmacellen en memory B-cellen.
o B-cellen doorlopen dus aantal keer proliferatie cyclus + krijgen aantal keer opnieuw
antigeenpresentatie (zelf of FDC) = germinal center rondes en hulp van TFH-cellen met
signaal 2 en 3 om opnieuw delingscyclus in te gaan → uiteindelijk hulp van TFH-cellen
voor proliferatie+differentiatie tot memory B-cellen en plasmacellen met een grote
affiniteit (grote bindingssterkte) voor antigeen en juiste Ig klasse.
o Na differentiatie tot plasmacellen + memory B-cellen, gaat een deel van de
plasmacellen migreren richting beenmerg voor inkapselen→ jarenlange bescherming
door antistofproductie. Ander deel (tijdelijke) plasmacellen komt in bloed terecht en
stoot daar antistoffen uit (humorale respons) voor aantal dagen tot een maand om de
infectie te klaren en sterven daarna uit.
7
, • IgG, IgA and IgE are formed through B cell class switching
= isotype switching see figure.
o Antigen binding domain = VDJ domain stays the same for each antibody class → every
Ig class has a specific constant domain → B class switch is generated via a controlled
recombination process via specific switch regions to move/rearrange the VDJ to a
constant domain of a different wanted class: this process is regulated by CD40
costimulation and Tfh cytokines (only learn principle, not all details in figure).
o De klasse Ig die een B-cel op zijn oppervlak heeft of uitscheidt kan veranderd worden,
door het constante domein van de huidige klasse Ig te vervangen door een constant
domein van een andere Ig klasse. Hierbij blijft de variabele regio hetzelfde, zodat de Ig
nog steeds specifiek blijft voor hetzelfde antigen, echter veranderd de functie van de
Ig (zie figuur).
o Ig klasses: IgM, IgD, IgG, IgE, IgA. Ieder wordt tot expressie gebracht door een uniek C-
gensegment in het genoom (die downstream liggen van de VDJ-gensegmenten).
o Het constante domein van iedere Ig klasse heeft een net iets andere bouw, wat maakt
dat iedere Ig klasse een unieke functie heeft → iedere Ig bestrijdt met zijn functie
specifieke pathogenen, omdat iedere pathogeen een unieke immuunrespons vereist.
o In eerste instantie komt IgM en IgD tot expressie (standaard Ig klasses) → dit kan met
isotype switch veranderd worden naar IgG, IgE, of IgA.
o Voor isotype switch vindt er somatische recombinatie plaats, waarbij de VDJ-regio van
de antistof gekoppeld aan het C-segment van het gewilde constante domein, en
wordt het ongewilde C-segment weggeknipt.
• B-cel klasse/isotype switch vereist CD40L, Th-cellen, en
cytokines. Het proces vindt plaats in het kiemcentrum
(GC):
o Voor de expressie van iedere klasse Ig moeten er specifieke cytokines
geproduceerd/aanwezig zijn (zie bovenstaand figuur).
o CD40 signaal zorgt voor deling van de B-cel (signaal 2)
o Cytokines (signaal 3) stimuleren mutatie voor hogere affiniteit van de BCR.
o De combinatie van signaal 2 en 3 (co-stimulatie + cytokines) zorgt ook voor
verandering van Ig klasse (bijvoorbeeld IgM naar IgG).
o Na isotype switch van de BCR bij de B-cel, kan vervolgens differentiatie plaatsvinden
tot een plasmacel die de nieuwe Ig klasse uitscheidt.
• Different antibodies have different effector functions: see
scheme
• Somatic (hyper) mutation (required for development of
higher affinity BCR) GC reactions is induced by CD40
ligation and Tfh cytokines (see figure) → mutations in Ig V
genes (variable region = V segment of VDJ domain/antigen
binding domain) → selection of high-affinity B cells!
Affinity maturation selects for high affinity B cells and thus gives rise to high affinity antibodies (see
figure): in de GCs van de lymfeknopen vindt dus de affiniteitsrijping en vorming van hoog affine
antistoffen plaat (zie figuren):
• Dochtercellen die na somatische hypermutatie zijn ontstaan uit proliferatie van geactiveerde
B-cel (na signaal 1, 2, en 3 van Th-cel bij B-T grensgebied) met een hoog affiene antilichamen,
migreren omdat ze opnieuw antigeen willen binden (selectie: kijken of affiniteit goed genoeg
is, anders nieuwe delingsronde in GC dark zone voor additional mutations, zie figuur) en zullen
in de GC light zone binden aan antigeen op de FDC om vervolgens TFH-cel hulp krijgen,
waardoor ze terug zullen gaan richting de GC dark zone voor proliferatie/somatische
hypermutatie/klasse switch, en uiteindelijk kunnen differentiëren tot plasmacellen + memory
B-cellen.
8
, • Dochtercellen die na somatische hypermutatie zijn ontstaan uit proliferatie van geactiveerde
B-cel (na signaal 1, 2, en 3 van Th-cel bij B-T grensgebied) met een laag affiene antilichaam
zullen in de GC light zone dus niet binden aan het antigeen op de FDC (geen BCR crosslinking)
en geen TFH-cel hulp krijgen, waardoor ze niet terug kunnen gaan naar de GC dark zone voor
proliferatie/somatische hypermutatie/klasse switch (geen nieuwe delingsronde/additional
mutations zoals in de figuur te zien bij gele B-cel) → deze B-cellen zullen achterblijven in de
GC light zone en doodgaan door apoptose (zie gele B-cel in figuur).
o Binding aan antigeen op FDC = signaal 1 (pro-apoptotisch), leidt tot opname-afbraak-
presentatie antigeen op MHC-II door hoog affiene B-cel voor TFH-hulp → heeft
signaal 2+3 nodig voor overleving.
o TFH-hulp = herkenning MHC-II:antigeen complexen op B-cel survival signals via CD40
(co-stimulatie) en cytokines = signaal 2 en 3 → hoog-affiene B-cel gaat terug naar GC
dark zone voor additional mutations (affiniteitsrijping).
Alleen hoog affiene B-cellen zullen dus hulp krijgen TFH-cellen, waardoor ze terug kunnen keren naar de
GC dark zone voor additional mutations om de affiniteit hoger te maken (affiniteitsrijping).
o De meerdere rondes doorlopen in de GC van een follikel is belangrijk zodat er na de GC reactie
met behulp van meerdere malen antigeen-presentatie en Th-cel hulp zoveel mogelijk hoog-
affiene B-cellen overblijven → hoog-affiene BCRs zijn handig, zodat na B-cel differentiatie, de
plasmacellen hun geproduceerde antistoffen als monomeer uit kunnen scheiden (aangezien
de antistoffen hoog affine zijn, binden ze al sterk/effectief genoeg als monomeer aan hun
antigeen). Daarnaast is een monomeer antilichaam voordelig door de vrije Fc-staart, die door
binding aan Fc receptoren op macrofagen voor optimale fagocytose van de pathogenen kan
zorgen → Zie figuur: Affinity maturation selects for high affinity B cells and thus gives
rise to high affinity antibodies
B cells, antibodies and SARS-CoV-2
• Pathogenesis of SARS-CoV-2 (see figure) → SARS-Cov-2 enters alveoli of lungs → DCs in alveoli
triggered → cytokine storm → tissue damage: lungs/liver/kidney, disease of blood: e.g.
leukopenia (low white blood cell count) etc.
• SARS-CoV-2 cell entry and replication: see figure for overview → Note: understand principle,
do not learn all proteins of this figure.
• SARS-CoV2- proteins, their functions and effects of observed mutations: see figure.
▪ ORF1a/b are part of the virus replicase → Mutations in ORF1a/b can allow the virus to
replicate better.
9
, ▪ N is needed for packaging of virus particles → Mutations in N can give better
packaging; more virus formation
▪ RBD = Receptor Binding Domain binds to ACE-R → RBD is part of S1
❖ Antibodies against RBD can be neutralising; inhibit virus entry in cells
❖ Mutations in RBD can give:
1. Better binding to ACE-R and thus higher infectivity of SARS-CoV-2
2. Escape from neutralizing antibodies
10
