Basisbegrippen chromatografisch systeem:
Stationaire fase: vaste of gelachtige stof waar de daadwerkelijke scheiding plaatsvind, stoffen met
een hoge affiniteit hiervoor komen traag de kolom uit.
Mobiele fase: een stof in gas of vloeibare vorm dat door de stationaire fase heen loopt (loopvloeistof)
Chromatografisch bed: kan worden gepakt in een glazen of metalen kolom, verdeeld een dunne laag
op een plaat van glas of kunststof, of geabsorbeerd op cellulosevezels.
Basisprincipe van chromatografie:
Scheidingstechniek waarmee een mengsel van stoffen gescheiden wordt op basis van fysische en
chemische eigenschappen van individuele componenten. Er wordt hierbij een kolom gebruikt met
daarin een stilstaande stationaire fase, hierop word de mobiele fase met de te scheiden sample
opgebracht die vervolgens langs de stationaire fase loopt. Gedurende de elutie zal de mobiele fase
een interactie aangaan met de stationaire fase. Stoffen met sterkere interactie lopen langzamer er
vanaf dan stoffen met een lage interactie.
Type chromatografie:
Dunne-laag chromatografie: De stationaire fase bestaat uit een dunne laag absorberend materiaal op
een stevige ondergrond. De mobiele fase loopt hier over heen door capillaire werking, wat geholpen
kan worden door zwaartekracht of elektronenpotentiaal. Dit gebeurt in een gesloten systeem
aangezien de mobiele fase een vluchtige apolaire stof is die snel zal verdampen. De loopafstand zegt
iets over de oplosbaarheid van de mobiele fase. Polaire stoffen blijven bij dunne laag chromatografie
onderin zitten en apolaire stoffen zullen over de dunne laag absorberende materiaal lopen. Detectie
van de stoffen gebeurt door aan kleuren m.b.v. Uv-licht of radioactiviteit. Voorbeeld van dunne-laag
chromatografie is TLC of papierchromatografie.
Papierchromatografie: Stationaire fase is een plaat die bedekt is met gel. Een spotter word op de
plaat gelegd met een stip in het midden. De mobiele fase wordt in een cilinder gedaan met een
kleine hoeveelheid stof, met daarin een stuk papier die zorgt dat je ziet of de cilinder verzadigd is. De
plaat word in de cilinder gedaan en gesloten, om verdamping te voorkomen. De monster loopt naar
boven door capillary action -> de gel zuigt de vloeistof op. Bij het einde haal je de plaat ervan af, met
een UV-lamp kan het monster gezien worden en kan bepaald worden of het polair of apolair is.
Kolom chromatografie: De stationaire fase word in een kolom aangebracht waarna telkens een
mobiele fase doorheen geschonken wordt. Door een monster toe te voegen loopt deze door de gel
heen. In de gel zitten balletjes met poriën, kleine eiwitten gaan hierdoorheen en grotere eiwitten
gaan erlangs. Zo komen de grote eiwitten eerder aan de onderkant terecht dan kleinere eiwitten.
Voorbeelden kolomchromatografie:
- HPLC: Identificeren van verschillende deeltjes in een mix. Aan het begin staat een solvent
met mobiele fase, met daarnaast een pomp die de vloeistof continue erdoorheen spoelt.
Daarnaast een injectiesysteem waar de monsters in de mobiele fase worden toegevoegd. Hij
gaat dan naar de kolom de stationaire fase in waar de monsters worden gescheiden op basis
van grote, polariteit, oplosbaarheid of adsorptie eigenschappen. Hij komt dan langs de
detector die signalen afgeeft aan een computer. Dit systeem is niet handig door eiwit
denaturatie
- FPLC: Deze wordt onder lage druk uitgevoerd en worden componenten gebruikt die geen
eventuele eiwit denaturatie veroorzaakt, dit systeem is ook bedoeld voor grotere moleculen
Paritie:
,Gelfiltratie:
Affiniteitschromatografie
Gaschromatografie: Langzaam proces voor het scheiden van deeltjes met verschillende kookpunten.
Wordt gebruikt voor het scheiden van vluchtige stoffen (gassen).
De RF en RX waarde berekenen bij dunne laag chromatografie:
Hierbij wordt de referentie met bekende concentratie gebruikt om de afstand te berekenen.
Een chromatogram interpreteren en de selectiviteit en resolutie berekenen aan de hand van een
chromatogram:
Een chromatogram is een grafiek van de gescheiden stoffen die verkregen zijn door chromatografie.
De pieken of patronen wijzen op het voorkomen van de componenten. Voor HPLC en
gaschromatografie krijg je via detectie een 2D weergaven tegenover de tijd. Voor PC en DLC krijg je
een papiertje met gescheiden vlekken bij de resultaten.
Een onderverdeling maken in chromatografische technieken naar uitvoeringsvorm. Gebruikte
stationaire- en mobiele fase scheidingsprincipe.
- DLC: Op basis van DNA, eiwitten, aminozuren. Scheiding op basis van lading.
- HPLC (kolom): Kleinere biologische moleculen op basis van retentietijd. Voornamelijk
gebruikt voor het aantonen van stoffen en de hoeveelheid ervan in een product.
- FPLC (kolom): Scheiden van grote moleculen zoals eiwitten of voor zuivering van een stof.
- Gaschromatografie: Vooral voor zuivering, scheiding en het identificeren van oplossingen
Het principe van adsorptie-, normal phase-, reversed phase- en hydrofobe
interactiechromatografie beschrijven.
- Adsorptie
o DLC en kolom
o Scheiding op basis van polariteit, waarin polair langzaam is en apolair snel.
o Stationaire fase= Vast (Apolair)
o Mobiele fase= Vloeibaar (Polair)
- Paritite
o DLC en kolom
o Beide stationaire en mobiele fase zijn vloeibaar, de scheiding vind plaats in
oplosbaarheid.
, o Normale fase: Stationaire fase = Polair, Mobiele fase = Apolair.
De polaire verbinding wordt als meest vertraagd, de mobiele fase minder polair
maken kan het proces versnellen.
o Reversed fase: Stationaire fase = Apolair, Mobiele fase = Polair
Apolair wordt hierbij het meest vertraagd, elutie kan versneld worden door het meer
of minder apolair te maken
Praktische toepasbare voorstellen doen om de resolutie tussen twee stoffen te verbeteren.
Resolutie is het verschil in retentietijden tussen 2 stoffen gedeeld door de piekbreedtes aan de bases,
de mate waarin stoffen worden gescheiden gedurende looptijd van het experiment. Om een
efficiënte scheiding te laten verlopen zijn er 3 mogelijkheden:
- Verlenging van kolom
- Kwaliteit van kolom materiaal verhogen
- Constante loopsnelheid.
- Helling zout gradiënt: flow rate langzaam genoeg voor effectieve scheiding en snel genoeg
voor minimale diffusie.
- Selectiviteit van een bepaalde chromatografische scheiding neemt toe als het verschil in
retentietijd toeneemt.
De verschillende vormen van detectoren van vloeistofchromatografie beschrijven.
Voor vloeistofchromatografie wordt onder andere detectoren gebruikt zoals: De spectrofotometer,
fluorescentie detector, brekingsindexdetector of ELSD. Wordt ook vaak gebruikt voor vaste stoffen
voor dunne-laag chromatografie wordt onder andere ook UV/Zichtbaar detectoren gebruikt
UV/zichtbaar detector: deze zijn veelzijdig, gevoelig en stabiel. 2 typen: Vaste en variabele golflengte,
vast wordt vaak gebruikt bij aminozuren en eiwitten
Fluorescentie detector: Nog gevoeliger dan de UV detector, hiermee kan in picogram range gekeken
worden.
Elektrochemisch detector: Hoge gevoeligheid en specificiteit voor de detectie van vitamine, thiolen
en purine
Berekenen wat de concentratie van een stof is aan de hand van een chromatogram waarin een
interne standaard is meegenomen.
Om de concentratie te berekenen van een bepaalde stof uit een chromatogram is het volgende
nodig: De hoogte van de piek, retentietijden van de te scheiden stoffen, concentratie van 1 van de
componenten met de daarbij behorende retentietijd en de hoeveelheid van een mengsel.
Voorbeeld:
Piekhoogte = 4,9 en deze staat voor een concentratie van 100mg/L
Dit staat dus voor 100/4,9= 20,4 mg/l/cm. Als je de concentratie van een piek van 2,5 cm wil weten
moet je 20,4 * 2,5 doen.
De basiszuur van een a-aminozuur kunnen tekenen en beschrijven
Een aminozuur heeft een centraal gelegen C-atoom, met hieraan een NH-groep (wat een H+ kan
opnemen) en een COOH-groep (wat een H+ kan afstaan), Hiernaast hebben aminozuren ook nog
restgroepen wat voor alle 20 aminozuren verschillend is. Wanneer aminozuren een verbinding
leggen heet dit dehydratie en vormt er een H2O molecuul.
Het principe van gelfiltratie uitleggen.
