Leerdoelen
- Je kunt, gebruikmakend van onderstaande technieken en strategieën formuleren om
onderzoekshypotheses te testen:
o DNA-extractie
o mRNA-extractie
o cDNA-productie
o PCR
o Gelelektroforese
o Restrictie-enzymen
o Ligatie
o Kloneren/transfectie
o Sequencing
o Microarray (h 14, maar zie ook Array CGH h17 (al behandeld) )
o CRISPR/Cas9
o Transgene dieren (boek)
DNA-extractie
1) Cellen verzamelen
2) Cellen kapot maken
o Lysisbuffer + warm waterbad cel- & kernmembraan gaan kapot, histonen
gaan kapot zodat DNA vrijkomt.
3) DNA scheiden van proteïnes etc.
o Geconcentreerde zoutoplossing proteïnes etc. klonteren samen
o Centrifuge proteïnes etc. zinken naar de bodem
o Overgebleven DNA-oplossing in ander epje.
4) Geconcentreerd DNA isoleren
o Isopropyl alcohol DNA klontert samen
o Centrifuge DNA zakt naar de bodem
o Verwijder overgebleven oplossing en laat DNA drogen
cDNA-productie
Stappen
1) Isoleer mRNA uit weefsel dmv van vissen met poly-T staart (mRNA-extractie).
2) cDNA productie dmv reverse transcriptase
o Primer (oligo dT) bindt aan mRNA template
o Reverse transcriptase complementaire DNA-streng
o RNase afbraak mRNA
o Oligonucleotide bindt aan ‘3 kant van cDNA
o DNA-ploymerase I en dNTP’s verlengen tot dubbelstrengs DNA
3)
,PCR
Benodigdheden
- Buffer (pH, zout, Mg2+)
- Template DNA (dubbelstrengs DNA dat target regio bevat)
- Primers (korte stukjes enkelstrengs DNA)
o Forward primer bindt aan onderste streng, leest 5’ – 3’.
o Reverse primer bindt aan bovenste streng.
o Primers zijn deel van het eindproduct.
o Lengte = 16-25 nucleotiden
- dNTP’s
- Taq-polymerase (hitte resistent)
Stappen
1) Denaturatie (95): waterstofbruggen breken enkelstrengs DNA
2) Annealing (45-70): primers binden aan complementaire sequenties
3) Elongation (72): Taq-polymerase start DNA-synthese vanaf primers
Agarose gelelektroforese
DNA is negatief geladen.
Gebruik
Grote mutaties
- Deletie of duplicatie > 50 bp
Kleine mutaties
- SNP, insertie of deletie
- Ontwikkel een selectieve primer
o WT geen PCR-product
o M wel PCR-product
Kloneren en transfectie dmv vectoren
Transfectie = construct in expressie systeem brengen
- Methode 1: PCR-producten met sticky-ends, primer bevat restriction site.
- Methode 2: Linkers, stukjes DNA met restriction site worden aan DNA geplakt.
Vector = artificieel construct dat vreemd DNA de cel in brengt (bijv. plasmide)
Een insert in een vector kloneren
- Restrictie-enzymen knippen specifieke DNA-sequenties in…
o insert-DNA sticky-ends
o vector-DNA sticky ends
- Ligase plakt twee DNA-fragmenten aan elkaar door fosfordiester-bindingen te
katalyseren.
, Sequencing
Voordelen:
- Slechts 1 reactie
- Langere reads mogelijk
Microarray (H14)
Waarom?
Verschil in genexpressie tussen twee verschillende cellen meten.
Stappen
1) mRNA-isolatie dmv poly-T staarten
2) cDNA-productie met gelabelde nucleotiden
3) Microarray hybridisatie (vorming bindingen tussen complementaire strengen)
o Microarray plaatje bevat in elk putje een cDNA-streng die complementair is
aan de mogelijk aan te treffen cDNA’s.
4) Level hybridisatie berekenen (door computer)
o Wit = genexpressie van gen beide soort cellen
o Rood = meer genexpressie van gen in rood gelabelde cellen
o Groen = minder genexpressie van gen in rood gelabelde cellen
o Geen kleur = geen genexpressie van dit gen
Kan niet:
- Laten zien welke genen slecht zijn (of ziektes veroorzaken).
- Ziektes genezen.
- Alle niet-juist werkende genen identificeren.
RT-qPCR = hoeveelheid RNA in weefsel kwantificeren
Voordelen van het kopen van samenvattingen bij Stuvia op een rij:
Verzekerd van kwaliteit door reviews
Stuvia-klanten hebben meer dan 700.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet je zeker dat je de beste documenten koopt!
Snel en makkelijk kopen
Je betaalt supersnel en eenmalig met iDeal, creditcard of Stuvia-tegoed voor de samenvatting. Zonder lidmaatschap.
Focus op de essentie
Samenvattingen worden geschreven voor en door anderen. Daarom zijn de samenvattingen altijd betrouwbaar en actueel. Zo kom je snel tot de kern!
Veelgestelde vragen
Wat krijg ik als ik dit document koop?
Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.
Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?
Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.
Van wie koop ik deze samenvatting?
Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper sennasie. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.
Zit ik meteen vast aan een abonnement?
Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €6,39. Je zit daarna nergens aan vast.
