Cursus Gaschromatografie en HPLC
Les 1
HPLC
Voorbewerking HPLC loopvloeistof (mobiele fase)
Vooraf filtreren om kleine deeltjes eruit te halen anders verstopt de kolom. Twee verschillende
filters:
.45 um: haalt de kleine deeltjes eruit (zakken naar beneden, lucht naar boven).
.22 um: bij micro-organismen. Filtert bacteriën eruit en gaat dus bacteriegroei tegen.
Ontgassen. Zit in de HPLC zelf. Wordt gedaan om luchtbelletjes eruit te halen. Voorbeelden om te
ontgassen: d.m.v. Helium of 1.5 uur in ultrasoon waterbad.
Pomp
Zorgt voor constante druk. Is nodig voor reproduceerbaar resultaat. Druk wordt opgebouwd. Bij
aanwezigheid van lucht wordt de flow beïnvloed waardoor de retentietijd verandert. Luchtbelletjes
langs de detector zorgen voor een storing van je resultaat. Dit wordt veroorzaakt doordat het licht in
de detector niet wordt geabsorbeerd maar wordt teruggekaatst. Karakteristiek voor deze pieken is
dat ze heel hoog zijn en afgeplat aan de bovenkant.
Er bestaan verschillende soorten pompen:
, - Zuigerpomp (d.m.v. zuiger)
/plunjerpomp (d.m.v. plunjers). Dit
soort pompen worden gebruikt om
vloeistoffen met plunjers van een lage
naar een hoge druk te brengen. Het
verschil tussen beide pompen is dat
een plunjerpomp vloeistof verplaatst
als een zuigerpomp, maar geen
hoeveelheid kan verplaatsen die
groter is dan het volume van de
plunjer zelf.
- Membraanpomp. Wordt gebruikt voor
het verpompen van gevaarlijke
vloeistoffen. Een soepel membraan
wordt door een zuiger op en neer bewogen en zo ontstaat een volumeverandering die
gebruikt wordt om de vloeistof te verplaatsen.
Injector
Er zijn twee verschillende soorten: autosampler en 2valve sampler.
Een injector heeft twee standen:
- Load stand: bedoeld om het systeem mee voor te spoelen. Alles wat er wordt geïnjecteerd
gaat naar het afvalvat.
Inject stand: het monster wordt het systeem geïnjecteerd.
- Ideale injector moet steeds dezelfde hoeveelheid kunnen injecteren. Wanneer je
verschillende volumes injecteert, injecteer je telkens een andere volume en zijn je resultaten
dus niet reproduceerbaar. Ook mag het materiaal aan de binnenkant van de injector niet
reageren met het monster.
Aan de leidingen in het systeem worden dezelfde bovengenoemde eisen gesteld. Leidingen in je
systeem moeten zo kort mogelijk zijn. Hoe langer in het systeem, hoe meer kans op piekverbreding.
Kolom
Bij HPLC kan er gebruik worden gemaakt van verschillende soorten kolommen. De meest gebruikte
kolommen zijn Normal Phase (mobiele fase apolair, stationaire fase polair) en Reversed Phase
(mobiele fase polair, stationaire fase apolair). Wanneer een component uit de kolom komt hangt af
van de affiniteit tussen het component en de stationaire fase. Wanneer een component veel
affiniteit heeft met de stationaire fase doet deze er langer over om door de kolom te komen. De
stationaire fase moet dus stabiel zijn.
Detector
- Moet het monster kunnen detecteren.
- Lineair aan de concentratie.
- Gevoeligheid detector moet groot genoeg zijn.
- Moet alleen het monster meten, en geen ruis. Signaal-ruis verhouding moet dus laag zijn.
Detector kan molecuuleigenschappen als kookpunt, smeltpunt, absorptie, geleidbaarheid en massa
meten. Je kunt alleen elektrische signalen meten. Dit komt omdat deze signalen elektronen bevatten.
Omzettingen naar elektrische signalen wordt gedaan met behulp van metalen.
,Enkele belangrijke termen
Solute opgeloste component
Solvent oplosmiddel
Solution oplossing
Elution elutie: vloeistof door een kolom leiden
Eluent vloeistof die de kolom in gaat
Eluate vloeistof die de kolom uitkomt
Dunnelaagchromatografie
Detectie: uv-detectie en kleuringsreactie.
Stationaire fase: silica. Aluminiumoxide, voor basische componenten.
Scheiding op basis van polariteit. Bestaat uit een vloeibare mobiele fase en vaste stationaire fase
(dragermateriaal + dun laagje stationaire fase voornamelijk silica).
De stationaire fase bestaat voornamelijk uit silica. Deze bestaat uit silanolgroepen (SiOH). Deze zijn
dipolair zwak en hebben een sterke waterstofverbinding. Afhankelijk van de lengte van de
koolstofketen, gebonden aan silcon, wordt de stationaire fase polairder/apolairder. Silica kan tot 3
lagen waterstofmoleculen binden.
Keuze loopvloeistof:
- Zijn de te scheiden componenten polair of apolair?
- Keuze loopvloeistof bij silica:
Onbekende componenten:
o start met pentaan/ethylacetaat mengsels
NON-polaire componenten
o gebruik pentaan/ether of pentaan/methyl-tert-butylether
Polaire componenten
o voeg butanon, methanol, dichloormethaan of ammonia toe.
Zeer polaire stoffen
o sec. butanol, ethylacetaat, azijnzuur,water (1:1:1:1).
o Bij zure componenten soms mierezuur toegevoegd, bij basen soms TEA of NH4OH
Gaschromatografie
Voor de mobiele fasen worden edelgassen gebruikt. Voornamelijk wordt er stikstof gebruikt.
De kolom heeft een dun filmlaagje aan de binnenkant.
,Retentietijden
De retentietijd is niet zo zeer de tijd die een component nodig heeft om door de kolom te komen
maar de tijd dat een component aanwezig is in het systeem. In onderstaand diagram staan tm, tr en
t’r aangegeven.
Tm staat voor de tijd van een onvertraagd component en tr voor de tijd van verblijf in de mobiele
fase voor componenten die wel vertraagd worden.
Dood volume: het volume vanaf de injectie tot
detectie dat zich buiten de kolom bevinden.
Hieronder valt het volume van de injector,
volume van de detector en het volume van alle
verbindingen tussen de injector, kolom en
detector.
Les 2
Doel chromatografie
Pieken zo dicht mogelijk op elkaar, maar ver genoeg van elkaar dat ze te onderscheiden zijn en
gemeten kunnen worden. Een scheiding dient geoptimaliseerd te worden. Hiervoor moet je weten
hoe de retentie beïnvloed kan worden en wat je kunt beïnvloeden.
Retentie
Een retentietijd is voor elk component te bepalen. De afkorting voor de retentietijd is tr. Deze
retentietijd is nodig om de netto-retentietijd (tr’) te berekenen.
De netto retentietijd wordt als volgt berekend:
Tr’ = tr – tm
Met tr’ netto retentietijd
Tr bruto retentietijd
Tm tijd van de onvertraagde component (dode tijd)
De retentie-/capaciteitsfactor is onafhankelijk van de flow en de lengte van de kolom, karakteristiek
voor een systeem en ligt vaak tussen 0,5 en 20. De retentie-/capaciteitsfactor wordt als volgt
berekend:
tr ' tr tm
k'
tm tm
Wanneer k’ hoog is wil dit zeggen dat je een hoge retentie hebt. Dit wordt veroorzaakt door veel
affiniteit met de stationaire fase.
Retentietijd kan worden beïnvloed door:
- Stationaire fase veranderen
- Mobiele fase
Zout toevoegen, verdeling stationaire en mobiele fase veranderd.
Gemakkelijker te veranderen. pH, zoutsterkte, hoeveelheid modifier.
Voor de verdelingscoëfficiënt geldt: K = Cs/Cm
Als deze verdeling optimaal zou zijn, wordt er een constante lijn gevormd in een grafiek. Wanneer
deze lijn afbuigt naar boven, dan is Cm dus hoog. Hierdoor neemt Cs onevenredig toe. Dit
, verschijnsel ontstaat door overbelading van de kolom. Er bindt zoveel aan de stationaire fase dat die
steeds meer op de te scheiden stof gaat lijken. K stijgt dus. Dit kan voorkomen worden door de
concentratie aan te pakken en komt voornamelijk voor bij lage concentraties.
Bij een afbuiging naar beneden heb je een lage Cm dat betekend dat een stof sterker bindt aan de
stationaire fase dan bij een hoge Cm. Als de concentratie weer afneemt, neemt de binding toe. Dit
resulteert in tailing. Dit kan voorkomen worden door de kolom beter te coaten en komt voornamelijk
voor bij lage concentraties.
Mocht er in het chromatogram een dip ipv een top ontstaan, is dit het resultaat van een water dip,
methanol/acetonitril piek.
Selectiviteit
Selectiviteit: vergelijkt twee pieken op basis van retentietijd. Wordt door elkaar gedeeld,
tweede/eerste. Altijd groter of gelijk aan 1. Bij 1 vallen pieken over elkaar. Zegt niks over hoe goed
stoffen scheiden, alleen of ze scheiden. Voor de selectiviteit geldt:
𝑡′𝑟2 𝑘′2
𝛼= =
𝑡′𝑟1 𝑘′1
De selectiviteit wordt beïnvloed door de relatieve (bruto) retentietijd.
Schotelgetal
Een goede selectiviteit wil niet zeggen dat de scheiding goed is. Een goede scheiding is ook
afhankelijk van de piekbreedte. Een schotelgetal zegt iets over de piekbreedte. Een schotelgetal is de
maat van efficiëntie. Hoe goed kan een stof van de kolom afkomen. Hoe hoger het schotelgetal, hoe
sneller evenwicht tussen de mobiele fase en stationaire fase, hoe scherper de pieken.
Voor het schotelgetal geldt:
N=L/H
H = schotelhoogte
L = lengte kolom
N =hoeveelheid schotels
Het schotelgetal kan gemeten worden door naar de piekvorm te kijken. Hiervoor geldt:
2 2
2 tR tR
tR
N N 16. N 5,545.
wb of w1/ 2
Bij meten vanaf de basis wordt er vermenigvuldigd met 16 (42), bij het meten vanaf het midden van
de piek wordt er vermenigvuldigd met 5,545 (2,352).
Resolutie
De resolutie zegt iets over hoe goed de scheiding is. Deze wordt bepaald door de afstand tussen die
pieken (selectiviteit), de breedte van de pieken (efficiëntie) en de retentie.
Resolutie: verschil in retentietijd / gemiddelde piekbreedte (bij geen gegeven, piekbreedte basis)
Bij halfhoogte -> correctiefactor van 0,85.
Rs wtr
(tr 2tr 1) (tr 2tr 1)
w1w2 0,85(w 0,5hw 0,5h)
2
Resolutie wordt bepaald door 3 parameters:
- Efficiëntie: aantal theoretische schotels N
- Retentie: k’ = (tr-tm)/tm
- Selectiviteit: alfa = k’2/k’1
