Samenvatting
Samenvatting onderdeel (q)PCR moleculaire detectie 2
samenvatting onderdeel (q)PCR moleculaire detectie 2
[Meer zien]Voorbeeld 2 van de 5 pagina's
Voorbeeld 2 van de 5 pagina's
In winkelwagengesponsord bericht van onze partner
Verkoper
Volgen
Voorbeeld van de inhoud
SAMENVATTING ONDERDEEL qPCR1. PCR en RT-PCR
1.1 PCR
Alle PCR’s zijn gebaseerd op hetzelfde principe met dezelfde stappen:
1. Denatureren bij 95 graden
2. Hybridisatie bij 55 graden
3. Elongatie bij 72 graden
PCR-producten worden gevisualiseerd op een agarosegel
Eindpunt PCR
Eind-punt PCR:
Geen informatie over de kinetiek van de reactie
Geen informatie over de starthoeveelheid van de sjabloon
Geen informatie over de effectiviteit van de amplificatie
1.2 RT-PCR
Reverse transcriptase PCR:
Maakt van RNA cDNA
o Moet eerst naar cDNA, omdat RNA niet stabiel is
Het enzym dat gebruikt wordt is Reverse transcriptase
Verder heb je nodig
o Primers
o dNTPs
o Water
o Buffer
Daagt het oorspronkelijke centrale dogma van de moleculaire biologie uit
RNA-afhankelijke DNA-polymerasen
Wat doe je bij RT-PCR:
o Isoleer totaal RNA of mRNA
o RNA moet je controleren op kwaliteit (bv nanodrop)
o Genomisch DNA eruit halen, zodat je alleen maar RNA overhoudt
Dnase I
RT-PCR primers
Drie soorten:
o Oligo(dT) primers
Specifiek voor poly(A) staarten
Alleen eukaryote mRNA's
Verankerde oligo (dT) is gemodificeerd aan 3'end
o Random primers
Korte, random sequenties
RT-PCR of RNA zonder poly(A) staarten
o Gen-specifieke primers
Ontworpen op basis van bekende volgorde
miRNA
, 2. qPCR
2.1 basis van qPCR
qPCR:
quantitatieve PCR (of Real-time PCR)
o Gevoelig en betrouwbaar
o Kwantitatief door fluorescent signaal tijdens amplificatie
o Hoeveelheid product kan na elke cyclus worden gevisualiseerd
Resultaten
o Fluorescerend signaal elke cyclus
o Ct-waarde is evenredig met invoerbedragen
o Meer cycli
Minder DNA
Fluorescerende kleurstoffen
o DNA-bindende middelen
SYBR green
o Hydrolysesondes
Taqman-probe
qPCR gebruik je wanneer je dingen wil kwatificeren:
Kwantificering van nucleïnezuren
1 of 2 of 3 (maximaal 20?) DNA/RNA-doelen
Doel is bekend
2.2 kleurstoffen
SYBR green:
Fluorescerende kleurstof
Bindt aan dsDNA (dubbelstrengs DNA)
Straalt licht uit wanneer gebonden
Meer fluorescerend signaal duidt op meer product
Niet specifiek, kan aan al het dubbelstrengs DNA binden
Taqman:
Kleurstof en quencher (demper > geen signaal) op een ssDNA (enkelstrengs DNA)
Probe bindt aan complementair DNA-fragment
Nieuw gesysnthetiseerde stam verdringt de sonde, waardoor fluorofoor vrijkomt
Elke cyclus meer fluorescentie
3. Primer design
Voor het kiezen van primers wordt onderscheid gemaakt tussen gDNA en (mRNA/)cDNA
Exon/exon border = er zijn geen intronen aanwezig.
Primers zijn specifiek voor cDNA, omdat gDNA nog intronen bevat.
Splice varianten = extra exon verwijderd
Geeft product lengte van 80-200bp
Doel: Bepalen of de expressie van een gen omhoog of omlaag gaat
We gaan hoeveelheid transcript meten van enkele specifieke genen
Voordelen van het kopen van samenvattingen bij Stuvia op een rij:
Verzekerd van kwaliteit door reviews
Stuvia-klanten hebben meer dan 700.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet je zeker dat je de beste documenten koopt!
Snel en makkelijk kopen
Je betaalt supersnel en eenmalig met iDeal, creditcard of Stuvia-tegoed voor de samenvatting. Zonder lidmaatschap.
Focus op de essentie
Samenvattingen worden geschreven voor en door anderen. Daarom zijn de samenvattingen altijd betrouwbaar en actueel. Zo kom je snel tot de kern!
Veelgestelde vragen
Wat krijg ik als ik dit document koop?
Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.
Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?
Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.
Van wie koop ik deze samenvatting?
Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper ahofstra00. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.
Zit ik meteen vast aan een abonnement?
Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €2,99. Je zit daarna nergens aan vast.
Is Stuvia te vertrouwen?
4,6 sterren op Google & Trustpilot (+1000 reviews)
Afgelopen 30 dagen zijn er 64438 samenvattingen verkocht
Opgericht in 2010, al 14 jaar dé plek om samenvattingen te kopen