Laboratory tools
Basisbegrippen scheidingsmethoden, gelfiltratie en affiniteit
chromatografie
De basiscomponenten noemen en beschrijven van een chromatografisch systeem en het
basisprincipe uitleggen
Chromatografie wordt gebruikt om de afzonderlijke bestanddelen in een monster te scheiden op
basis van verschillen in hun fysische kenmerken, bijvoorbeeld moleculaire grootte, vorm, lading,
vluchtigheid, oplosbaarheid en/of adsorptievermogen
Chromatografiesysteem bestaat uit 2 fasen (die niet mengbaar zijn):
- Stationaire fase: fase (vast of vloeibaar), de kolomvulling
- Mobiele fase: (vloeibaar of gas) het eluens (vloeistof die wordt opgebracht)
Stoffen met een hoge affiniteit voor de stationaire fase komen vertraagd van de kolom
Je hebt preparatieven en analytische chromatografie. Het verschil is dat je bij preparatief ook wilt dat
het product dat je scheidt intact blijft
Typen chromatografische systemen (scheidingssystemen)
Kolom chromatografie: de stationaire en mobiele fase bevinden zich in een kolom.
De stationaire fase wordt constant aangevuld en de scheidingen worden los van
elkaar opgevangen. Het nadeel van kolom chromatografie is dat er diffusie
ontstaat, waardoor de banden breder worden en de scheiding minder. Door de
druk te verhogen neemt de elutie snelheid toe, dit zorgt voor een betere scheiding.
Hiervoor worden hogedruk pompen gebruikt:
HPLC: High performance liquid chromatography
- Hoge druk, componentensysteem moeten bestand zijn tegen druk
- Vooral geschikt voor kleine biologische moleculen
FPLC: Fast Protein Liquid Chromatography
- Lagere druk, componenten die geen eiwit-detanuratie veroorzaken
- Grotere moleculen zoals eiwitten
Soorten kolom chromatografie: gelfiltratie, affiniteit, adsorptie, partitie, ion-
exchange
Dunnelaagchromatografie: heeft een dunne laag absorberend materiaal (de
stationaire fase) op een stevige achtergrond. De mobiele fase beweegt over de
stationaire fase door capillaire werking. Dit moet uitgevoerd worden in een
afgesloten bak omdat de mobiele fase een vluchtige apolaire stof is die kan
verdampen.
Gaschromatografie: mobiele fase is een gas
Praktisch toepasbare voorstellen doen om de resolutie tussen twee stoffen te verbeteren
Resolutie (de mate waarmee stoffen worden gescheiden tijdens de looptijd) tussen twee stoffen
verbeteren kan met behulp van drie mogelijkheden:
- Lengte van de kolom verlengen
- Kwaliteit van het kolommateriaal verhogen, gebruik kleinere deeltjes
- Constante doorloopsnelheid (pomp aansluiten)
Bij een R > 1 is het mengsel pas echt goed gescheiden, tussen de 0 en 1 kan je een van de
bovenstaande methodes toepassen
,Een chromatogram interpreteren en de selectiviteit en resolutie bereken aan de hand van dit
chromatogram
Dode tijd/ volume: de tijd/ volume die nodig is voor de mobiele
fase om de kolom te verlaten (T0 , V0)
Retentie tijd: de tijd tussen injecteren van het monster en het
midden van de piek van het eluaat
Bruto retentie tijd: Tr
Netto retentie tijd: T’r = Tr – T0
Selectiviteit: hoe ver liggen de pieken uit elkaar?
!"#!$
a = !%#!$
Resolutie: het verschil tussen de pieken in verhouding tot de breedte
ervan
&(!%#!")
R = )%*)"
Schotgetal: de efficiëntie van een kolom (maat voor de hoeveelheid
pieken die je goed gescheiden van elkaar van een kolom kun krijgen),
deze kan worden verhoogd door: de lengte van de kolom te verlengen,
de kwaliteit van het kolom materiaal (kleinere deeltjes), constante
doorloopsnelheid
Een onderverdeling maken in chromatografische technieken naar uitvoeringsvorm, gebruikte
stationaire en mobiele fasen en scheidingsprincipe
Gelfiltratie: uitvoering in kolom, scheiding op basis van grootte, beide fasen zijn vloeibaar
Affiniteit: uitvoering in kolom, scheiding op basis affiniteit
Adsorptie: kolom of dunnelaagchromatografie, mobiele fase is vloeibaar, stationaire fase is vast,
scheiding op basis van polariteit
Partitie: kolom, scheiding op basis van oplosbaarheid
- Normal phase: mobiele fase is apolair, stationaire fase is polair
- Reversed phase: mobiele fase is polair, stationaire fase is apolair
Ion-exchange: kolom, scheiding op basis van lading
De verschillende vormen van detectie bij vloeistofchromatografie beschrijven
Voor vloeistofchromatografie worden onder andere de volgende detectoren gebruikt:
- UV-absorptie
- Fluorescentie
- Radioactiviteit
- Elektrochemische detectie
- Kleurstoffen
Het principe van de gelfiltratie uitleggen
Gelfiltratie wordt gebruikt om eiwitten van verschillende grootte van elkaar te
scheiden. Het principe van gelfiltratie berust erop dat kleine eiwitten een langere
weg door een poreuze matrix moeten afleggen dan de grote eiwitten. Het gevolg is
dat kleine eiwitten later van de kolom elueren dan grote eiwitten.
De opstelling voor gelfiltratie bestaat uit een glazen kolom, gevuld met
microscopisch kleine bolletjes van een inert, sterk gehydrateerd polymeermateriaal
De molmassa van eiwitten is in het fractioneringsbereik evenredig met de log van
de molmassa
, De mol massa berekenen van een onbekend eiwit als het elutie volume bekend is en er
voldoende marker eiwitten zijn met een bekende mol massa en bekend elutie volume
Eerst moet je a (richtingscoëfficiënt) bepalen dit doe
∆,
je met behulp van de volgende formule: ∆-
Daarna kan je de formule y = ax + b zo veel mogelijk
invullen en b berekenen.
Vervolgens gebruik je de formule om de onbekende
mol massa te berekenen. Van dit antwoord bereken
je de log en dat is de mol massa in kDa
Het principe van affiniteitschromatografie beschrijven
Bij affiniteitschromatografie worden eiwitten gescheiden op basis van hun biospecifiteit in plaats van
op fysische/ chemische eigenschappen. Affiniteit = bindingssterkte/ bindingskracht
Het gebruik van verschillende eiwit-tags uitleggen en de methode kunnen beschrijven en
toepassen
Je hangt een labeltje aan het eiwit van interesse, hiermee kun je
bijvoorbeeld gaan kijken naar eiwit-eiwit interactie
GST: GST bindt aan glutathion van de kolom, vervolgens doe je er
als competitie glutathion (mobiele fase) bij, dit zal gaan binden
aan GST en als elutie eruit komen
His-tags: je plakt histidine aan je eiwit vast, die binden goed aan
metaal. Je voegt alleen de ring structuur van histidine (imidazole)
toe aan de stationaire fase, dit gaat vervolgens weer competitie
aan met het histidine in de stationaire fase, het eiwit valt volgens
samen met de imidazole van de kolom
IgG: antilichamen worden hiervoor gebruikt. Alles wat niet aan het antilichaam bindt valt door de
kolom heen
Flag-tag: het ligand is een flag-antilichaam en de elutie is de flag peptide (ook competitieve binding)
Streptavidine: het ligand is biotine/ avidine, de elutie is biotine (ook competitieve binding)
Verschillende elutie methodes noemen en uitleggen hoe ze werken en wat de voor- en
nadelen zijn
Methoden van elueren:
- Verandering van bijvoorbeeld zoutconcentratie of pH è verbindingen breken; nadeel: eiwit
denatureert als de pH te veel wordt aangepast
- Verandering waardoor ligand en/ of te zuiveren eiwit denatureert
- Competitieve binding van een stof aan het ligand (je voegt het ligand in overmaat toe, zodat
de kans dat het eiwit bindt aan het ligand van de mobiele fase groter is dan dat het bind aan
het ligand van de stationaire fase)
- Competitieve binding van een stof aan het te zuiveren eiwit
Eluaat: vloeistof die van de kolom af komt
Eluens: schone vloeistof die de kolom in loopt
