Samenvatting alle stof BA204
Uitgebreid
Zelfstudie week 1 Pharmaceutical Biotechnology & Recombinant DNA Technology ........................................................... 3
Samenvatting HC: recombinant DNA .............................................................................................................................................................................3
Biologicals................................................................................................................................................................................................................................................................. 3
Transcriptie en translatie .......................................................................................................................................................................................................................................... 3
Eukaryoot vs prokaryoot ........................................................................................................................................................................................................................................... 5
Recombinant eiwitten en cloning.............................................................................................................................................................................................................................. 5
Samenvatting kennisclip: geschiedenis van farmaceutische biotechnologie ....................................................................................................................6
Samenvatting kennisclip: introductie farmaceutische biotechnologie + quizvragen .........................................................................................................7
Overzicht van small molecule geneesmiddelen vs biofarmaceuticals: ....................................................................................................................................................................... 8
Samenvatting vragen m.b.t DNA, RNA en eiwitten .........................................................................................................................................................8
Samenvatting vragen m.b.t expressievectors ............................................................................................................................................................... 12
Samenvatting kennisclip DNA cloning ..................................................................................................................................................................................................................... 12
Samenvatting kennisclip restrictie-enzymen & DNA ligase ...................................................................................................................................................................................... 13
Extra informatie uit de vragen ................................................................................................................................................................................................................................ 13
Samenvatting Zelfstudie week 2 Cloning and PCR ............................................................................................................ 15
Samenvatting HC: recombinant DNA technologie: clonen en PCR ................................................................................................................................. 15
PCR ......................................................................................................................................................................................................................................................................... 15
Plasmide ................................................................................................................................................................................................................................................................. 16
Selectie ................................................................................................................................................................................................................................................................... 18
Samenvatting H1. Molecular Biotechnology: From DNA Sequence to Therapeutic Protein ............................................................................................ 18
Samenvatting PCR and cloning tutorial + bijbehorende vragen ..................................................................................................................................... 20
PCR ......................................................................................................................................................................................................................................................................... 20
Gel electroforese .................................................................................................................................................................................................................................................... 21
Informatie uit de vragen ......................................................................................................................................................................................................................................... 21
Samenvatting informatie test yourself ........................................................................................................................................................................ 22
Extra info uit Wooclap ............................................................................................................................................................................................................................................ 22
Samenvatting zelfstudie week 3 Protein structure & upstream processing ...................................................................... 23
Samenvatting HC upstream processing ........................................................................................................................................................................ 23
Keuze van gastheercel ............................................................................................................................................................................................................................................ 23
Monoklonale antilichamen (mAB)........................................................................................................................................................................................................................... 24
Plasmide in gastheercel krijgen ............................................................................................................................................................................................................................... 24
Selectie van juiste hostcellen .................................................................................................................................................................................................................................. 25
Doel eiwitten kweken ............................................................................................................................................................................................................................................. 26
Kweken cellen......................................................................................................................................................................................................................................................... 26
Samenvatting quiz over opbouw eiwitten en eukaryote/prokaryote cellen .................................................................................................................. 27
Samenvatting video upstream processing. ................................................................................................................................................................... 28
Samenvatting H.4 Production and Purification of Recombinant proteins (blz. 57-63)..................................................................................................... 28
Samenvatting oefenvragen over Upstream Processing ........................................................................................................................................................................................... 30
Samenvatting BP Classen en Nomenclatuur ................................................................................................................................................................. 31
International Nonproprietary Name (INN) .............................................................................................................................................................................................................. 31
Samenvatting oefenvragen ......................................................................................................................................................................................... 33
Samenvatting Zelfstudie week 4 Downstream Processing & Purification .......................................................................... 34
Samenvatting Purification and Formulation ................................................................................................................................................................. 34
Productie en impact op purificatie .......................................................................................................................................................................................................................... 34
Van cel(puin) naar gepurificeerd eiwit .................................................................................................................................................................................................................... 36
Eiwitten vangen met een tag .................................................................................................................................................................................................................................. 37
Beoordelen van de purificatie ................................................................................................................................................................................................................................. 38
Samenvatting vragen .............................................................................................................................................................................................................................................. 39
1
, Aanvullende informatie HC + Wooclap ........................................................................................................................................................................ 40
Samenvatting purificatie ............................................................................................................................................................................................. 41
Samenvatting H.4 Production and purification of Recombinant protein (onderdeel downstream processing) ................................................................ 41
Samenvatting examenvragen ...................................................................................................................................................................................... 43
Samenvatting Week 5 – Formulation & Protein Stability .................................................................................................. 45
Samenvatting HC eiwit stabiliteit en formulering ......................................................................................................................................................... 45
Algemene informatie stabiliteit .............................................................................................................................................................................................................................. 45
Vriesdrogen ............................................................................................................................................................................................................................................................ 46
Samenvatting stabiliteitsproblemen ............................................................................................................................................................................ 50
Samenvatting slides ................................................................................................................................................................................................................................................ 50
Samenvatting quizvragen........................................................................................................................................................................................................................................ 51
Samenvatting verbetering van eiwitstabiliteit door drogen .......................................................................................................................................... 52
Samenvatting slides ................................................................................................................................................................................................................................................ 52
Samenvatting quizvragen........................................................................................................................................................................................................................................ 53
Samenvatting H.5 Formulation of Biologics including biopharmaceutical consideration ................................................................................................ 53
Samenvatting oefeningen eiwit stabiliteit en hulpstoffen ............................................................................................................................................ 55
Samenvatting examenvragen ...................................................................................................................................................................................... 58
Samenvatting tussentoets 1e 5 weken ......................................................................................................................................................................... 59
Samenvatting week 6 – Farmacokinetiek ......................................................................................................................... 60
Samenvatting HC Farmacokinetiek van biofarmaceuticals ............................................................................................................................................ 60
1-compartimentenmodel ........................................................................................................................................................................................................................................ 60
2-compartimentenmodel ........................................................................................................................................................................................................................................ 60
Meervoudige dosering ............................................................................................................................................................................................................................................ 62
Klaringsroutes ......................................................................................................................................................................................................................................................... 63
Samenvatting Afleveringsroutes van proteïne therapeutica ......................................................................................................................................... 64
Samenvatting H.5 blz. 95-101 (leveren van geneesmiddelen) ................................................................................................................................................................................. 64
Samenvatting slides farmacokinetiek van biofarmaceuticals ........................................................................................................................................ 66
Samenvatting HC slides ........................................................................................................................................................................................................................................... 66
Samenvatting quizvragen........................................................................................................................................................................................................................................ 67
Samenvatting H.6 Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Therapeutic Peptides and Proteins (t/m blz. 119) ........................................................ 67
Samenvatting oefenvragen ..................................................................................................................................................................................................................................... 68
Samenvatting slides immunogeniciteit ........................................................................................................................................................................ 69
Immunogeniciteit: .................................................................................................................................................................................................................................................. 69
Samenvatting HC Half-life Engineering ........................................................................................................................................................................ 70
Samenvatting slides ................................................................................................................................................................................................................................................ 70
Samenvatting quizvragen........................................................................................................................................................................................................................................ 71
Samenvatting virale veiligheid/BSE ............................................................................................................................................................................. 72
Samenvatting slides ................................................................................................................................................................................................................................................ 72
Samenvatting quizvragen........................................................................................................................................................................................................................................ 73
Samenvatting virale klaring ......................................................................................................................................................................................... 73
Samenvatting quizvragen........................................................................................................................................................................................................................................ 75
Samenvatting oefenvragen over farmacokinetiek van biologicals ................................................................................................................................. 75
Samenvatting oefententamen..................................................................................................................................................................................... 77
Samenvatting week 8 - Evaluatie van gezondheidstechnologie: Economie en ethiek ........................................................ 78
Samenvatting HC Health technology assessment (HTA) ................................................................................................................................................ 78
Algemene info + health technology assessment...................................................................................................................................................................................................... 78
Nederlands zorgstelsel ............................................................................................................................................................................................................................................ 79
Samenvatting personalized medicine en Economie ...................................................................................................................................................... 82
Samenvatting Het besluit over de vergoeding van een nieuw biologisch product .......................................................................................................... 83
Samenvatting Het gebruik van economische evaluaties bij de besluitvorming .............................................................................................................. 84
Samenvatting examenvragen ...................................................................................................................................................................................... 85
2
,Zelfstudie week 1
Pharmaceutical Biotechnology & Recombinant DNA Technology
Samenvatting HC: recombinant DNA
Biologicals
Biologicals zijn biologische producten/geneesmiddelen die voor vele verschillende dingen
ingezet kunnen worden. Denk aan vaccins, bloed/bloedcomponenten, allergenen, als
somatische cellen, als gentherapie, als weefsles en als recombinant therapeutische eiwitten.
Deze biologische producten kunnen bestaan uit suikers, eiwitten, nucleïnezuren of complexe
combinaties van deze stoffen, maar kunnen ook leven in levende entiteiten zoals
cellen/weefsels.
Deze biologicals kunnen geïsoleerd worden van natuurlijke bronnen zoals mensen, dieren,
micro-organismes en geproduceerd worden via biotechnologische methodes en cutting-
edge technologie.
Voor de productie van deze eiwitten zijn een aantal eisen:
Het moet de correcte aminozuurvolgorde hebben, de correcte sterochemie, juiste
kwaliteittest en vouwing ondergaan, de juiste posttranslationele modificaties hebben,
eventueel een tag toegevoegd.
Voor de productie hiervan wordt recombinant DNA gecloond, vervolgens vindt er
eiwitproductie plaats in de hostcel, daarna purificatie en tot slot formulering en opslag.
Transcriptie en translatie
Het DNA bestaat uit 2 strengen. De DNA coding stand welke van 5’naar 3’loopt. De DNA
template strand welke van 3’ naar 5’ loopt.
De DNA coding strand wordt ook het mRNA, waarbij thymine wordt vervangen voor uracil.
Dit mRNA kan tegen de DNA template streng aangemaakt worden?
De mRNA streng kan vervolgens per 3 nucleïnezuren, wat een codon is, vertalen tot een
aminozuur. Meerdere van deze aminozuren aan elkaar vormt een peptideketen.
Vormen van eiwitten in Eukaryote cellen:
Eukaryote cellen hebben DNA. Vlak voor de
startzijde van de transcriptie zitten promotors
en eventuele regulatie-elementen. Dit DNA
bevat intronen en exonen, waarbij intronen
geen functie hebben en exonen vertalen voor
eiwitten.
Vanaf de transcriptiezijde vindt er transcriptie
plaats door polymerase II, waardoor pre-mRNA
wordt gevormd.
Vervolgens vindt er splicing plaats, waardoor de
intronen worden verwijders. Verder wordt er
3
,aan de 3’UTR zijde een poly-A signaal t oegevoegd, wat een keten is van adenine. Na de
splicing blijft mRNA over.
Dit mRNA kan vertaald worden tot een polypeptideketen. Deze keten ondergaat daarna
posttranslationele modificaties, waardoor er een eiwit wordt gevormd.
Spliching zorgt ervoor dat verschillende exonen naast elkaar komen te liggen. Dit is
alternatieve splicing. Je kan dan een mRNA krijgen met exon 1 t/m 5, een mRNA met exon 1,
2, 4 en 5, etc. Dit leidt tot verschillende eiwitten.
Het uiteindelijke mRNA heeft een startcodon, wat de beginzijde van het coding segment is
en een stop codon, wat het einde van het coding segment is. Verder heeft het nog de poly-A
staart en een 5’Cap welke voor het coderende segment zit.
Het gevormde RNA gaat vervolgens de nucleus ut het cytoplasma in. Hier vindt translatie
plaats van het mRNA.
Een ribosoom hecht aan het mRNA. Vervolgens komt er een transfer-RNA (tRNA) met
daaraan een aminozuur naar het ribosoom, waar het anticodon van tRNA zal binden met het
codon van het mRNA. Het aminozuur zal aan de peptideketen gekoppeld worden, waarna
tRNA weer loslaat.
Het tRNA wordt gevormd door aminoacyl-tRNA synthetase.
De groeiende peptideketen heeft een ER signaal. Dit ER signaal wordt herkend door een
signaal-herkennings partikel (SRP), welke vervolgens bindt met de SRP receptor op het ER-
membraan. Vervolgens gaat de peptideketen via het translocatiekanaal vanuit het cytosol
het endoplasmatisch reticulum (ER) lumen in. Hiervindt eiwitvouwing, posttranslationale
modificaties en transport plaats.
Het vouwen zorgt ervoor dat er een secundaire, tertiaire en quaternaire structuur wordt
gevormd.
De secundaire structuur zijn de beta-sheets (welke uit 3 strengen bestaat) en de alfa-helix.
De tertiaire structuur is de 3D-structuur van al deze beta-sheets en alfa-helixen.
De quaternaire structuren is een combinatie van meerdere monomeren, die samen het eiwit
vormen.
Polypeptide:
Dit is een keten van meerdere aminozuren. Het wordt gevormd door peptidebindingen
tussen 2 aminozuren. Hierbij gaan de N-terminus en C-terminus een binding met elkaar aan,
waarbij de N-terminus een H+ verliest en de C-terminus de OH-groep, waardoor er water
wordt gevormd bij het vormen van een peptidebinding.
Posttranslationele modificaties:
Dit zijn modificaties die plaatsvinden nadat het eiwit is gevormd. Deze modificaties zorgen
ervoor dat het eiwit veranderd en afgemaakt wordt. Glycosylatie en disulfidebindingen zijn
belangrijke posttranslationele modificaties.
4
, N-glycosylatie:
Dit is het proces van N-
gebonden glycosylering. Hierbij
wordt er een oligosacharide
(wat een koolhydraat is,
gevormd uit verschillende
suikermoleculen, soms ook wel
glycaan genoemd) gekoppeld
aan een N-atoom.
Eukaryoot vs prokaryoot
Bij een prokaryote cel is er geen
nucleus, het DNA zit vrij in het
cytosol. Een eukaryote cel heeft wel een nucleus,
waar RNA transcriptie en verwerking plaatsvindt,
om zo mRNA te krijgen. Dit mRNA gaat daarna
naar het cytosol, waar het vertaald wordt tot
eiwitten (mbv ribosomen).
Verder wordt het mRNA vertaald tijdens
transcriptie, ipv eerst vorming van mRNA en
daarna transcriptie.
Recombinant eiwitten en cloning
Voor het vormen van recombinant eiwitten moet er cloning plaatsvinden.
Een bacterie/eukaryote cel wordt gevormd voor het produceren van eiwitten.
Om het juiste gen in de bacterie te krijgen wordt er gebruik gemaakt van een plasmide.
Plasmide is circulair DNA welke wordt gevonden in bacteriën. Deze kunnen instructies
krijgen voor specifieke eiwitten.
Voor een plasmide zijn een aantal elementen belangrijk:
Origin of replication (ORI), het gen van interesse, een promotor (welke translatie bevordert),
een open reading frame (ORF) (dit is het deel welke vertaald kan worden), een poly-A signaal
voor productie in eukaryote cellen) en een weerstandsgen (welke gebruikt wordt om
bacteriën te selecteren die het goede eiwit produceren).
Om een nieuw plasmide te maken neemt je een lege vector met een multiple cloning site
(MCS). Hier laat je restrictie-enzymen de vector openknippen, zodat de correcte sequentie
(gen) ingebouwd kan worden.
Dit plasmide kan vervolgens geamplificeerd worden in bacteriën, waarbij de sequentie
gecontroleerd moet worden.
Voor het produceren van recombinant eiwit moet het plasmide in een geschikte hostcel
geplaatst worden. Deze groeicellen moeten de juiste nutriënten krijgen. Vervolgens kan het
eiwit geïsoleerd worden.
5
