Samenvatting deel 2 algemene biochemie Christophe Ampe Bart Devreese
16 keer bekeken 1 keer verkocht
Vak
Biochemie (C003944A)
Instelling
Universiteit Gent (UGent)
Boek
Algemene biochemie
Samenvatting boek algemene biochemie van Christophe Ampe en Bart Devreese. Behandeld hoofdstuk 7 tot het einde. Zelf les gehad van B. Devreese, 15/20 mee gehaald. Chemie/Biochemie (BCBT) aan UGENT 1e jaarsvak. Begrippenlijst + samenvatting deel 1 ook te vinden zie bundel
Samenvatting algemene biochemie deel 1 Christophe Ampe, Bart Devreese
Algemene biochemie samenvatting van het boek geschreven door Christophe Ampe en Bart Devreese. Biochemie en biotechnologie.
Alles voor dit studieboek
(4)
Geschreven voor
Universiteit Gent (UGent)
Chemie
Biochemie (C003944A)
Alle documenten voor dit vak (3)
Verkoper
Volgen
hannahmeuleman
Ontvangen beoordelingen
Voorbeeld van de inhoud
BIOCHEMIE DEEL 2: EIWITTEN
STS
1. Inleiding: chemische begrippen
2. De bouwstenen: AZ, suikers-polysacchariden, nucleotiden (nucleïnezuren), lipiden en
membranen
3. Eiwitten en hun structuur
4. Functie van eiwitten
5. (Biomedische toepassingen)
HOOFDSTUK 7: EIWITTEN - PRIMAIRE STRUCTUUR
7.1 Inleiding
• “Actieve” moleculen van de cel =
=> eiwitkatalysatoren (=enzymen) voor alle moleculaire transformaties van cellulair metabolisme
=> regulatorische rol
=> essentieel als structurele component van de cel
• Eiwit = lineaire polymeer AZ, functie wordt bepaald door zijn structuur (AZ sequentie)
• Primaire structuur = de aminozuursequentie (covalente peptidebinding: CO-NH)
• Volgorde belangrijk: bepaalt eigenschappen en rol en de mechanismen waarmee rol vervult wordt
• Geen uniforme reglmatige structuur
• Sequenties op publieke databanken UNIPROT en NCBI (US, mindeer gecontroleerd)
7.2 Diversiteit van eiwitten
7.2.1 Inleiding
• In vivo gesynthiseerd (polymerisatie AZ), volgorde bepaald door sequentie nucleotiden in gen [Sequentie
wordt vastgelegd door de DNA sequentie van het gen dat codeert voor dit eiwit (afgelezen van N nr C
terminus)]
• Directe relatie tussen lineair DNA-polymeer en polypeptide => overdracht informatie mogelijk
7.2.2 Theoretisch: onbeperkt
• Diverse structuur: theoretisch 20^n de macht mogelijkheden (kan groter worden dan aantal
atomen in universum … dus
• Tijdens evolutie slecht beperkt aantal mogelijkheden werkelijk geproduceerd
• Humane cel meer dan 10.000 eiwitten
7.2.3 Beperkingen: grootte en samenstelling:
• Variatie van tussen de 40 en 1000 AZ (meestal tussen 1000 en 1000)
=> 40 minimale lengte voor sabiele opvouwing en voor geven van specifieke functie
=> meer dan 1000: te veel kans op mutaties, minder efficiënte synthesatie
• Peptide = kleinere polypeptiden
• Groote bekende: titine met bijna 30.000 AZ (spiervezels)
• Beperking qua samenstelling: sommige AZ zelfdzamer dan andere door genetische code
(sommige maar door 1 triplet gecodeerd, andere door 6)
• Beperking qua positie: hydrofobe altijd centrum, hydrofiele zijkant oppervlak => bepaalde
regio’s voor bepaalde AZ
• Meer dan 1 polypeptide die soms covalent of niet covalent zijn gebonden: de
multisubeenheideiwitten
• Eventuele cofactoren: complexvorming met metaalionen of kleine organische moleculen en
posttranslationele modificaties (processing: gensequentie levert niet noodzakelijk de exacte
informatie over de uiteindelijke primaire structuur) zorgen voor nog meer diversiteit
• Sommige eiwitten worden door 1 gen gecodeerd en later enzymatisch in stukken geknipt:
bv insuline
=>protease => vorming proinsuline (niet actief)
=> op moment dat suiker spiegel te hoog wordt gaat prikkel waarbij B-cel een
proteïne produceert dat opnieuw een protease die knipt en dan krijg je insuline
7.3 Evolutie van eiwitten
1
,7.3.1 Inleiding en evolutie van eiwitsequenties
• Primaire structuren identieke eiwitten in verwante organismen lijken sterk op elkaar => afstamming van
“vooroudergen (gen dat codeert voor eiwit bij gemeenschappelijke voorouder van deze organismen)
• Veranderingen door willekeurige mutaties (kan enkel bewaard blijven indien levenskansen verhoogd of
gelijk blijven. Er is geen tolerantie voor mutaties die functie aantasten, dan sterft organisme af. , basis
survival of the fittest)
• Neutral drift: mutaties die functie van eiwit niet aantasten zijn neutrale mutaties sluipen toch binnen
Voorbeeld cytochroom c
=> komt zowat bij alle eukaryoten voor , AZsequenties bij deze organismen bepaald
=> vergelijken met elkaar: equivalente AZ onder elkaar te liggne (alignatie)
=> kijken naar de posities: op aantal posities meerdere AZ getolereerd + ondersteunign van theorie
van gemeenschappelijk ‘vooroudergen’, homoloog: uit gemschp. Vooroudergen gëevolueerd
=> geconserveerd eiwit (voorla te vinden bij eiwitten die belangrijke cellulaire functies uitvoeren)
• Vb geconserveerd eiwitten: Cysteïne en Histidine (binding cofactoren, heemgroep), Glycine (betrokken in
lussen)
• Conservatieve mutaties = mutaties die eigenschappen van AZ niet veranderen
7.3.2 Sequentievergelijking en fylogenetische stambomen
• Sequentievergelijking leert ons iets over rol van AZ in eiwit
• Belangrijke AZ met belangrijke structurele of functionele rol bewaard doorheen evolutie
Bv; Als we op bepaalde posities in eiwitsequentie van verwante eiwitten dan kunnen we stellen dat chemische
of structurele eigenschappen van dat onvariabele aminozuur essentieel zijn voor opvouwing of voor functie
eiwit
• Anderen hypervariabel: om het even welke functionaliteit is toegelaten
• Sequentievergelijkingen => evolutionaire verwantschappen => opmaak van stambomen (meer betrouwbaar
dan fossiele gegevens) = moleculaire fylogenie (subtak moleculaire evolutie, bio-informatica)
• Deze fylogenetische stambomen kennen we ook op basis van morfologische gegevens
• Vertakking op de boom: punt waarbij verdere afstammelingen gemeenschappelijke voorouder hadden
• Snelheid waarmee eiwit kan wijzigen hangt af van de mate waarmee een dergelijke wijziging de functie
zou aantasten, aantal mutaties verschilt sterk
=> Histon H4 is nauwelijks veranderd: verantw voor opvouwen DNA
=> fibrinopeptide (in eiwit fibrinogeen) wordt vrijgezet bij bloedstolling maar heeft zelf geen
verdere functie en wordt daarna zelfs afgebroken, geen evolutieve druk om sequentie in stand te
houden
7.3.3 Genduplicatie en eiwitfamilies
• Eiwitten met soortgelijke sequenties stammen meestal van gemeenschappelijke voorouder af
• Binnen 1zelfde organisme vindt je ook eiwitten die sterk op elkaar gelijken = eiwitfamilie door
genduplicatie
• genduplicatie (spontaan recombinatieproces met als resultaat dat stuk DNA een 2de keer herhaald wordt op
chromosoom: gen 1 behoudt oorspronkelijke functie gen 2 krijgt een nieuwe
• Voorbeeld: globines (transport zuurstof)
=> hemoglobine
=> transport zuurstof longen naar weefsels
=> tetrameer alfa2beta2 (2 alfa en 2 beta polypeptiden samengebracht)
=> myoglobine
=> transport zuurstof in spieren
=> sequentie alfa en beta keten sterk gelijkend op dat van hemoglobine
=> dus geevolueerd uit gemeenschappelijke voorouderglobine
=> duplicatie: globine evolutie tot monomere alfa keten en nieuwe duplicatie zal aanleiding gegeven
hebben tot ontstaan van beta polypeptideketen
=> uit bèta keten bestond dan bv gamma-hemoglobine enzovoort
• Pseudogenen = gen dat gelijkstoortige DNA structuren bezit als normaal functionerend genen maar codeert
niet voor een functoneel eiwit
7.4 Methodieken tot eiwitzuivering
7.4.1 Algemene aanpak - stabilisatie eiwitten - eiwitassays
• Zuivering fundamenteel om eiwitten fysiochemisch te karakteriseren
• Eiwit zeer klein drooggewich van cel (0.1 %) dus isolatie is nodig
2
,• Veel eiwitten die betrokken zijn bij basale metabole processen, expressie of doorgeven van genetische
informatie worden bestudeert => bewaard gebleven (mensen doen deze processen nog steeds) =>
voldoende om deze eiwitten te bestuderen bij eenvoudige Mico-organismen
• Minder geconserveerde eiwitten gaan werken op eiwitmateriaal uit toegankelijker hoger organisme dat
nauwer verwant is met mens
• Moleculair klonen: eiwit in gastheercellen aanmaken en in zeer grote hoeveelheden te produceren => tot
40% van drooggewicht laten uitmaken => makkelijker isolatieproces
• Studie van eiwitten: zuivering, bepaling primaire structuur en activiteit en uiteindelijk structuur
Eiwitzuivering
=> Keuze van de bron? (+ rekening houden met ethiek)
1) isolatie uit celmateriaal
=> cellen vernietigd door lyse of mechanische beschadigdingen met vrijstelling celmateriaal,
=> in oplossing brengen, soms gebruik van detergenten voor eiwitten verankerd aan celmembraan
=> eiwitten dienen gestabiliseerd te worden
• pH mag niet te ver van fysiologisch pH liggen anders risico op denaturatie
• Vaak bij 4°C, sommige eiwitten denatureren bij hoge temperaturen
• Vrijstelling van degraderende eiwitten (nucleasen, proteasen) onder controle houden door
pH van buffer of T aan te passen tot niveau waarop enzymen inactief zijn of inhibitoren voor
deze enzymen toedienen
2) Assay = traceren van eiwit tijdens de zuivering
=> kwanitiatief, test op basis van natuurlijke activiteit
=> methode die toelaat om te bepalen of eiwit aanwezig is (bv. Enzymatische test met kleurreactie)
=> bv. Voor enzym beetje van elke fractie aan substraat toevoegen en nagaan bij welke fractie de
omzetting tot producten het grootst is, om op die manier terug te vinden in welke fractie het eiwit
zich bevindt
3) scheidingsmethoden (op basis van polariteit, lading, grootte, olosbaarheid).
=> hoofdbetrachting: selectief verwijderen van andere componenten tot zuiver product
=> eigenschappen van eiwitten exploiteren
7.4.2 Scheidingsmethoden
7.4.2.1 Scheiding door gebruik te maken van verschil in oplosbaarheid
• Positief geladen groepen van eiwitten kunnen in waterig midden zoutbruggen vormen met negatieve
geladen groepen van datzelfde eiwit, maar ook van andere eiwitten (aggregatie => neerslag) maar door
toevoeging van zout (tegenionen) worden de onderlinge reacties tussen eiwtitten geminimaliseerd (zout
bindt met eiwit) = inzouten => oplosbaarheid neemt toe met Ionaire sterkte (zoutconcentratie), drm
experimenteren in buffer met zouten
• Uitzouten is wnr we Ionaire sterkte te hoog is => “competitie voor water” = te weinig solvent beschikbaar
om eiwit in oplossing te houden => neerslaan
• ! Proteïnen slaan neer bij verschillende zoutsterktes: eerst de minder oplosbare eiwitten neerslaan en steeds
fractioneren in groepen met dezelfde oplosbaarheid
• Praktijk: zout tot onder niveau dat gewenste eiwit neerslaat => neerslaan van minder oplosbare => in
centrifuge neerslaan en bovenstaande vloeistof terug nemen en weer zout toevoegen waarbij gewenste
percipiteert en afcentrigugeren
• Vaak gebruikt: ammoniumsulfaatprecipitatie (heeft zelf zeer hoge oplosbaarheid)
• pH = pI zorgt voor minimale oplosbaarheid, eiwit is dan elektrisch neutraal dus onderlinge aggregatie
minimaal en slaat makkelijker neer
7.4.2.2 Chromatografie
• Eiwitmengsel in oplosmddel (vloeibare fase) gebracht en over kolom met poreuze matrix (stationaire fase)
gegoten
• Retentie = componenten die goed interageren met stationaire fase gaan trager migreren
• Voor stationaire fase: synthetische polymeren zoals polyacrylamide of silica (bestand tegen hoge drukken
=> staat gebruik van pompen toe [tegenwoordige chromatografie])
• Oudste techniek is papierchromatofragie
a) ionenuitwisselingschromatografie (gebaseerd op lading)
• Stationaire fasen met geladen groepen
3
, => anionuitwisselingschromatografie: kolommateriaal
positief (!) [eiwitten die sterkst negatief zijn zulllen het
langst op de kolom blijven)
=> kationuitwisselingschromatografie: kolommateriaal
negatief (kationen binden) (eiwitten die sterkst positief
geladen zijn zullen het langst op de kolom blijven]
• Lading aminozuur die eiwit vormen hangt af van bij welke pH
het voorkomt: rekening mee houden in opgaves!
• Al dan niet interageren hangt af van pH buffer en andere ionen
die in competitie kunnen gaan voor binding met kolom
1) eiwitten worden opgelost in buffer met bepaalde pH
en relatief laag zoutgehalte: niet-bindende eiwitten
meegespoeld
2) vervangen door buffer met hoge zoutconcentratie: zout
in competitie met eiwitten voor binding aan kolom dus gedeelte eiwitmateriaal vloeit uit kolom
=> kortom: stapsgewijze toename zoutconcentratie, eiwitten 1 voor 1 geulueerd
• Buffer is het eluens, kolom is het eluaat
b) hydrofobe interactiechromatografie (op basis van polariteit)
kolommateriaal waarop octyl- of fenylgroepen gebonden zijn (hydrofoob) => apolaire zijketens van eiwitten
gaan daarmee reageren vooral bij hoge zoutconcentraties => hydrofobe eiwitten binden dus sterker dan
hydrofiele eiwitten => zoutconcentratie/concentratie detergent variëren en zo stapsgewijs
eiwitten van kolom elueren (1st: hydrofiele, later hydrofobe)
c) Gelfitratie (volgens vorm & grootte)
• Niet echt gebaseerd op fysiochemische interacties maar volgens vorm en grote
• Stationaire fase bevat parels die poriën bevatten van zeker grootte
• Waterige oplossing van eiwitmengsel => zeefeffect
• Kleinere moleculen in porie en gaan dus trager, grote sneller
d) Dialyse (moleculair gewicht)
• Beperkt tot scheiding van componenten die heel erg verschillen in moleculair gewicht
• Ontzouten van stalen na ammoniumsulfaatpercipitatie
• Sstaal in ‘zakje geladen’ + oplossing laag buffergehalte => zakje gemaakt van membraan met specifieke
poriegroote => kleine zoutionen kunnen diffunderen en eiwitten blijven achter
• Evenwicht: zoutgehalte binnen = zoutgehalte buiten
e) Affiniteitcchromatografie (zeer specifiek, affiniteit)
• Ligand covalent gebonden aan interene matrix en aangebracht op kolom
• Gewenste eiwit zal interactie aangaan, want affiniteit voor ligand, de rest spoelt
mee met buffer
• Gebonden eiwit kan gewonnen worden door pH sterk veranderen
Bijzondere vorm: immuno-affiniteitschromtografie
Gebaseerd op gebruik van antilichamen => Konijn inspuiten met vreemd eiwit en
na tijdje wordt serum van konijn gerecupereerd waaruit je antlichaam kan
zuiveren en kunnen gebruikt worden voor aanmaak chromatografische kolommen voor meer efficiente
zuivering => verbetering rendement x 10
f) detectie (assay)
• Einde van chromatofrafie: detectiesysteem gebaseerd op uv-absorptie
• Normaal eiwitten absorberen rond 260-280 nm golflengte licht (door aromatische groepen)
• Bij eluatie: registreren van vermindering transmissie van licht naar een optische detector
• Fluorescentietechnieken, massaspectrometrie of geleidbaarheidsmetingen ook gebruikt
7.4.2.3 Gelelektroforese (polariteit)
• Meer analytische methode om beeld te krijgen op samenstelling
• Migratie van geladen moleculen in elektisch veld (snelheid RE met
ladingsdichtheid, vorm & grootte)
• Matrix met portiegrootte, polymeer van agarose of acrylamide (gel)
4
Voordelen van het kopen van samenvattingen bij Stuvia op een rij:
Verzekerd van kwaliteit door reviews
Stuvia-klanten hebben meer dan 700.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet je zeker dat je de beste documenten koopt!
Snel en makkelijk kopen
Je betaalt supersnel en eenmalig met iDeal, creditcard of Stuvia-tegoed voor de samenvatting. Zonder lidmaatschap.
Focus op de essentie
Samenvattingen worden geschreven voor en door anderen. Daarom zijn de samenvattingen altijd betrouwbaar en actueel. Zo kom je snel tot de kern!
Veelgestelde vragen
Wat krijg ik als ik dit document koop?
Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.
Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?
Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.
Van wie koop ik deze samenvatting?
Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper hannahmeuleman. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.
Zit ik meteen vast aan een abonnement?
Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €7,79. Je zit daarna nergens aan vast.
