Casus 1
Leerdoelen:
1. Technieken: wat kan je wel vinden en wat niet met de techniek? Kan je er bijvoorbeeld
microdeleties mee opsporen?
a. Karyotypering
b. FISH
c. SNP
d. MLPA
e. Kort: whole genome sequencing
f. Sanger sequencing (dan kom je vanzelf bij PCR)
2. Wat is dysmorfie? Hoe bekijk je het?
Technieken
Karyotypering m.b.v. de lichtmicroscoop is de standaardtechniek voor het opsporen van
chromosomale afwijkingen bij patiënten met een ontwikkelingsachterstand. Een belangrijk
nadeel van deze techniek is de lage resolutie. Een structurele verandering in een chromosoom
moet wel 5‐10 miljoen baseparen omvatten om zichtbaar te zijn door de microscoop. Met
deze techniek wordt in ongeveer 5% van de patiënten een afwijking gedetecteerd. Bij de overige
patiënten wordt vaak een gericht FISH onderzoek gedaan om te zoeken naar een specifiek
microdeletie syndroom. Hierbij wordt in ongeveer 4% van de gevallen een afwijking gevonden.
Bij de patiënten bij wie dan nog geen diagnose gesteld is, wordt een subtelomeren test met
MLPA gedaan. Dit levert in ongeveer 5‐7% van de gevallen een afwijking op.
Recent is een moleculaire techniek beschikbaar gekomen met een hoge resolutie, die de drie
bovengenoemde onderzoeken combineert in één experiment. Met deze (SNP) array techniek
kunnen meer dan honderdduizend plekken op de chromosomen tegelijk gemeten worden. Door
deze hoge resolutie kan bij meer patiënten, ongeveer 15 tot 20%, een diagnostische afwijking
worden gevonden. Het array onderzoek is sneller en levert meer op. Wanneer een genetische
verandering bij de patiënt gevonden wordt, zullen tevens de ouders onderzocht worden. Wij
zullen dan voorstellen de patiënt te presenteren bij een klinisch geneticus in ons centrum.
Techniek: SNP-array
Voor het array onderzoek gebruiken we een commerciële array van Affymetrix; de Genechip
Human Mapping 250K Array Set (www.affymetrix.com ). Deze array is 1,28 cm bij 1,28 cm
groot en bevat ruim 250.000 stukjes DNA van 25 baseparen lang. De stukjes DNA zijn verspreid
over het gehele genoom, met uitzondering van het Y‐chromosoom, zodat ongeveer elke 6000
baseparen een meetpunt zit op het genoom. Het genomische DNA van de patiënt wordt gelabeld
met een fluorescerende marker. Vervolgens wordt het gelabelde DNA op de array gebracht. Het
gelabelde patiënten DNA zal binden aan de overeenkomende DNA stukjes op de array. Door de
intensiteit van het fluorescerende signaal te meten en te vergelijken met normale controle
personen kan bepaald worden of er op een meetpunt te veel (duplicatie) of te weinig DNA
(deletie) aanwezig is.
Met het Affymetrix SNP‐array platform kan het gehele genoom (m.u.v. het Y‐chromosoom)
geanalyseerd worden met een gemiddelde resolutie van ongeveer 200 kb (Hehir‐Kwa et al.,
2007). Deze resolutie geldt niet voor alle regio's, zoals centromeergebieden en
heterochromatische regio's. Gebalanceerde afwijkingen kunnen niet met SNP‐array analyse
,gedetecteerd worden. Laag mozaïeke deleties en duplicaties, aanwezig in minder dan 20% van
de cellen, zijn niet met zekerheid te detecteren.
Analyse:
De hoeveelheid DNA op een meetpunt op een bepaald chromosomaal locus wordt bepaald door
de ratio voor dit meetpunt te berekenen tussen het intensiteitsignaal van de patiënt en een
controle persoon. Een DNA segment > 1000 baseparen aanwezig in een variabel kopie aantal
(niet gelijk aan 2 kopieën) vergeleken met een controle genoom noemen we een kopienummer
variant. Dit kunnen inserties, deleties en duplicaties zijn. Bij de analyse doet zich echter een
probleem voor dat zich ook al bij het standaard chromosomenonderzoek voordeed, namelijk de
‘normale’ fysiologische variatie, ofwel polymorfie van chromosomen van de mens. Tot wel 12%
van de humane genoomsequentie kan in kopie aantal variëren zonder dat dit consequenties heeft
voor de gezondheid. Dit betekent dat wanneer we met een veel hogere resolutie naar
chromosomen gaan kijken, we vele varianten zullen vinden waarvan moet worden vastgesteld of
ze de oorzaak zijn van het klinisch fenotype bij de patiënt, of dat het een onschuldige variant is
zonder klinische relevantie.
Een voorbeeld van een analyse is hieronder weergegeven. De plot laat een deletie op de korte
arm van chromosoom 10 zien. Elke rode stip in de bovenste plot is een individueel meetpunt. Op
de verticale as staat de intensiteit van een meetpunt vergeleken met controle personen. De
waarde 0 is gelijk aan 2 kopieën, > 0 is een duplicatie en < 0 is een deletie. De plot met
de blauwe lijn laat een gemiddelde van 10 meetpunten op een rij zien. De horizontale as laat de
positie van een meetpunt langs het chromosoom zien.
Technieken relatief
Naast de klassieke karyotypering zijn nieuwe detectiemethoden voor prenatale diagnostiek in
ontwikkeling met een duidelijke biotechnologische achtergrond, zoals:
Kwantitatieve fluorescentie PCR (QF-PCR). Hierbij worden kleine stukjes DNA vermeerderd
(geamplificeerd) en fluorescent gelabeld, waardoor het gemeten kan worden. Deze techniek kan
direct worden toegepast op vruchtwatercelen of placentavlokken om vast te stellen hoe vaak een
gen (of stuk chromosoom) aanwezig is in vruchtwater of placentacellen. Daarmee is QF-PCR
geschikt om te testen op afwijkende chromosoomaantallen (aneuploidieën), zoals op trisomieën.
Het resultaat van QF-PCR is beschikbaar na een paar uur.
Fluorescence in-situ hybridisation (FISH). FISH is een snelle (resultaten binnen 24-48 uur),
moleculair cytogenetische techniek die gebruik maakt van fluorescent gelabelde DNA-probes om
,afwijkingen aan te tonen met een fluorescentiemicroscoop. FISH kan worden toegepast op
ongekweekte cellen om afwijkingen in het aantal chromosomen aan te tonen. Daarnaast kan in
gekweekte cellen gezocht worden naar specifieke, kleine afwijkingen. Meestal wordt daarbij
gebruik gemaakt van een mengsel van verschillende probes, zodat in één keer alle afwijkingen
tegelijk in beeld worden gebracht. Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA).
Ook MLPA is geschikt voor relatieve kwantificering van circa 40 verschillende DNA sequenties
in één reactie. Hiervoor kan een kit worden gebruikt die door een Nederlands bedrijf is
ontwikkeld. Deze test maakt gebruik van het vermeerderen van bekende DNA fragmenten. Ook
hiermee wordt vooral gekeken naar aneuploidieën (trisomie 13,18,21 en X of Y), maar
de techniek biedt veel meer mogelijkheden.
In essentie geldt voor al deze technieken dat gebruik wordt gemaakt van ongekweekte cellen.
Daarmee is sneller en gerichter chromosoomonderzoek mogelijk. Bovendien is het onderzoek
goedkoper en kunnen grote aantallen monsters tegelijk verwerkt worden. Inmiddels zijn grote
aantallen (>20.000) testresultaten van de snelle testmethoden vergeleken met de resultaten van
conventionele karyotypering. Zowel QF-PCR, FISH als MLPA, blijken snel, eenvoudig en
betrouwbaar te zijn.
MLPA
Multiplex Ligation-dependant Probe Amplification.
Dit is een ‘high-througphut’-methode (hoge doorvoersnelheid-methode), ontwikkelt om het
aantal kopieën van maximaal 50 genomische DNA-sequenties in een enkele multiplex PRC-
gebaseerde reactie. Er kunnen maximaal 96 monsters tegelijkertijd worden behandeld, waarbij de
resultaten in 24 beschikbaar zijn. MLPA is gemakkelijk uit te voeren, vereist slechts 20 ng DNA
monster en kunnen sequenties onderscheiden die slechts in een enkele nucleotide verschillen.
De MLPA reactie leidt tot een mengseel van amplificatie-fragmenten variërend van 100-500 nt
in lengte die kunnen worden onderscheiden en gekwantificeerd door capillaire electrophorese.
Het matriaal voor MLPA is identiek aan die voor het uitvoeren van standaard sequencing
reacties: een thermocycler en een fluorescent capillair elektroforese systeem. Met behulp van
vergelijking van de verkregen piekpatronen van het DNA-sample met het referentiemonster,
indiceert welke sequenties afwijkende aantallen kopien vertonen.
Fundamenteel voor de MLPA-techniek is dat niet het monster-DNA/DNA-sample wordt
geamplificeerd in de PCR reactie, maar MLPA probes hybridiseren met de DNA-sample. Elke
MLPA-probe bestaat uit 2 probe-oligonucleotiden die tegen het doelwit DNA hybridiseert voor
een succesvolle ligatie
Slechts geligeerde probes kunnen exponentieel worden geamplificeerd met PCR. In tegenstelling
tot multiplex PCR, wordt slechts 1 paar van de PCR-primers gebruikt voor de MLPA-PCR
reactie, resulterend in een meer robuust systeem. Zo is het relatieve aantal fragmenten die
aanwezig zijn na de PCR reactie afhankelijk van de relatieve hoeveelheid van de doelsequentie
aanwezig in een DNA-sample.
, Hoe werkt het?
1 MLPA probe bestaat uit 2 probe-oligonucleotiden. Als de probe doelsequentie aanwezig is in
de DNA sample van de patient, hybridiseren de 2 probe oligos naast elkaar. De gehybridiseerde
probe oligo’s zijn verbonden door ligatie. De geligeerde probes worden geamplificeerd in een
multiplex PCR; niet de sample nucleïnezuren, maar de toegevoegde MLPA-probes aan de DNA-
sample worden geamplificeerd door PCR!
De PCR reactie is zeer reproduceerbaar, aangezien slechts een paar PCR-primers worden
gebruikt voor amplificatie van alle fragmenten. Daarnaast genereert elke probe een
amplificatieproduct van een unieke lengte. Deze amplificatieproducten (130-490 nt) worden
geanalyseerd met behulp van capillaire elektroforese. De verschillen in relatieve hoeveelheden
probe-doelsequenties in de DNA-sample resulteert in verschillende relatieve piekhoogtes tussen
patientmonster en het referentiesample.
Bij het vergelijken van MLPA met FISH, heeft MLPA niet alleen het voordeel dat het een
multiplexe techniek is, maar ook waarin zeer kleine (50-70 nt) sequenties de doelsequenties
kunnen zijn. Hierdoor kan MLPA de frequente, enkele gen afwijkingen opsporen die te klein zijn
om door FISH te worden gedetecteerd.
Bovendien kan MLPa worden gebruikt op ‘gezuiverd DNA’.
Kortom
