Lesson 1
Concept 1.1 Eiwitten
Eiwitten hebben een grote variatie aan (ruimtelijke) structuur, wat resulteert in a carbon
grote verscheidenheid in functies
P
Eiwitten zijn (onvertakte) polymeren gebouwd uit een set van 20 aminozuren
Aminozuren zijn opgebouwd uit een aminogroep, carboxylgroep en een R-groep C C
Aminozuren beschikken over verschillende eigenschappen door verschillen R-
groepen
Een kort aminozuur polymeer wordt een peptide genoemd, veel aminozuren bij Amino Carboxyl
elkaar wordt een polypeptide genoemd en een eiwit bestaat uit 1 of meer N C
polypeptide
Concept 1.2 Eiwit functies
Enzymatische eiwitten:
Versnellen chemische reacties (selectief)
Defensieve eiwitten:
Bescherming tegen ziektes
Opslag eiwitten:
Opslag van aminozuren
Transport eiwitten:
Transport van substanties/ stoffen
Hormonale eiwitten:
Vaststellen van activiteiten afkomstig van organismes
Receptor eiwitten:
Reactie van een cel op chemische stimuli
Contractiele en motorische eiwitten:
Beweging
Structurele eiwitten:
Ondersteuning
Concept 1.3 Aminozuur als ziwtterion
Zwitterion: verbinding met zowel een positieve lading als een negatieve lading op hetzelfde molecuul
Aminozuren zijn ionische verbindingen en de ladingsopbouw is afhankelijk van de pH
/PH
7 pH
14
1 7
=
-
= -
Excess H+ / Excess OH-
Zuur Basisch
-
pI = 0
↑ & &
3 3 2
,Concept 1.4 Eiwitstructuur
Structuur 1 Primaire structuur
I
De unieke lineaire volgorde van aminozuren
Beschikt over een N H+ kop en een COO staart
-
3
Structuur 2 Secundaire structuur
Spiralen (coils) en vouwing (folds) van de polypeptide keten
a helix:
Draait met de klok mee en bevat 3,6 aminozuren
H-brug tussen de carboxyl- en aminogroep
B helix:
Plaatvormige structuur die parallel en antiparallel kunnen zijn
H-brug tussen de intra- of interchain en de backbone
Random coils:
Weinig eiwitten bestaan alleen uit a-helixes en B-pleated sheets
Niet repeterende secties vormen ‘random coils’
Structuur 3 Tertiaire structuur
3D structuur bepaalt functie en reactiviteit
De volgende interacties vormen een 3D structuur:
Covalente bindingen: peptide binding en S-brug
Waterstof bruggen: backbone en zijketens
Electrostatische interactie: zoutbruggen/ metaal ion
Hydrofobe interacties
Structuur 4 Quaternaire structuur
Twee of meer polypeptide ketens vormen 1 complex macro-molecuul
Concept 1.5 Eiwit isolatie & zuivering
Voorbehandeling
Wassen: verwijdering van verontreinigingen
Veel gebruikte buffers:
PBS: Phosphate Buffer Saline
Tris buffer sucrose
Osmoticum (om cel lysis te voorkomen)
Cel disruptie - I
Heftige lysis methode (mechanisch)
Sonificatie probe (cel suspensie): gebruikt ultrasound energie
French press ((micro)organismen met celwand): cellen lyseren onder druk
Vijzel & mortier ((vast weefsel, (micro)organismen): malen met vloeibaar stikstof
Beadbeating ((cel suspensie, (micro)organismen): met glas, staal of keramische kralen
Vortexen
,Cel disruptie - II
Voorzichtige lysis methode (chemisch)
Osmotische lysis (celkweek/ cel supensie): gebruik hypotone oplossing
Freeze thaw ((micro)organisme): bevriezen in vloeibaar stikstof
Lysis onder invloed van detergentia ((micro)organisme): lysis buffer met bijvoorbeeld urea of SDS
Enzymatische lysis (planten, (micro)organisme)): lysozyme voor bacteriën, cellulase/ pectinase voor
planten, lyticase/ glucanase voor gisten en schimmels
, Lesson 2
Concept 2.1 Eiwit kwantificatie/ analyse methoden
UV meode
Principe: de aromatische groepen van aminozuren (Tryptophan, Tyrosine en Phenylalanine) hebben een
maximum UV absorptie ronde de 280 nm. De peptide bindingen van de backbone absorberen het beste
tussen de 190 en 240 nm. Het gevormde complex kan gemeten worden bij het optimum van 280 nm.
Gevoeligheid: > mg
Nadelen: alles met een fenol groep interferereerd bij 280 nm
Biureet meode
2t
Principe: wanneer peptide bindingen binden aan Cu ionen in CuSO (CuSO is het Biureet reagens en is
4 4
van zichzelf blauw) onder alkalische omstandigheden, wordt er een paars Biureet-complex gevormd. Dit
kan gemeten worden bij het optimum van 540 nm. Hoe intenser de paarse kleur, hoe hoger de
absorptie, hoe meer peptide bindingen in het monster.
Gevoeligheid: >1 mg
Voordelen: snel en makkelijk in gebruik
Nadelen: lage gevoeligheid
Lowry meode
Principe: hetzelfde als de Biureet methode, maar gevolgd door een extra reactie. Onder basische
omstandigheden kan het peptide nitrogens binden aan Cu ionen, gevolgd door de reductie van het
27
Folin’s reagens (bestaande uit phosphotungstic- en phosphomolubdic acid). Deze reductie vindt vooral
plaatst met aromatische aminozuren zoals, tyrosine en tryptophan (maar ook cysteine, histidine en
asparagine). Het gevormde complex kan gemeten worden bij het optimum van 750 nm. Hoe intenser de
blauwe kleur, hoe hoger de absorptie.
Gevoeligheid: >0,1 mg
Voordelen: 10x zo gevoelig als de Biureet methode
Nadelen: onder andere storen de volgende verbindingen: aminozuur derivaten, sommige buffers, zouten,
nucleïne zuren, etc.
Bradford meode
Principe: onder zure omstandigheden zal Coomassie Briljant Blue G-250 dye aan de basische en
aromatische zijketen van de eiwitten binden. Door de binding zal er een kleuromslag plaatsvinden van
roodbruin naar blauw en een absorptie-shift van 465 nm naar 595 nm. Het gevormde complex kan
gemeten worden bij het optimum van 595 nm. Hoe intenser de blauwe kleur, hoe hoger de absorptie.
Gevoeligheid: >10 - 100 ug
Voordelen: goedkoop & snel. Zeer sterke interactie met arginine
Nadelen: aminozuren, peptiden en eiwitten met een laag molecuulgewicht (<3000 Da) kunnen niet
gedetecteerd worden. Mindere sterke interactie met aromatische aminozuren
,Bicinchoninic acid (BCA) meode
Principe: hetzelfde als de Biureet methode, maar gevolgd door een extra reacties. De Cu ionen worden
2+
gereduceerd in de peptide bindingen (CuSO omzetting naar Cu ). De tweede reactie vindt plaats door
1+
4
de binding van twee moleculen BCA met 1 Cu ion, waarna er een kleuromslag plaatsvinden van groen
1+
naar paars. Het gevormde complex kan gemeten worden bij het optimum van 562 nm.
Gevoeligheid: 20 - 2000 ug
Voordelen: stabieler, gevoeliger & minder storing dan de Folin-Lowry methode
Nadelen: voor hoge gevoeligheid moet deze methode uitgevoerd worden bij 60 C
Concept 2.2 Eiwit elektroforese
Elektroferese: een techniek waarbij geladen moleculen in oplossing (eiwitten, nucleïnezuren) migreren in
respons op een elektrisch veld en de snelheid van de migratie is afhankelijk van:
Veldsterkte
Netto lading
Grootte en vorm van de moleculen
Viscositeit
Temperatuur van het medium
Doel eiwit elektroforese
SDS-Page: bepaling van relatief moleculair gewicht (Mw)
IEF: bepaling van iso-elektrisch punt (pI)
2D: bepaling Mw en pI samen
Principe eiwit elektroforese
Rol van vaste matrix (de gel):
Voorkomen van diffusie en convectie
Extra scheiding door ‘moleculaire zeefwerking’
Maakt visualisatie mogelijk door kleuring na de run
De matrix: agarose of polyacrylamide
Zeer verschillend fysisch/ chemisch, wel allebei poreuze gelen
Poreuze gel: werkt als een zeef en houdt tegen/ belemmerd beweging van de grote moleculen t.o.v.
de kleine moleculen
Agarose
Agarose: gezuiverde ongeladen polysaccharide uit agar
Agarose gelen zijn kwetsbaar
Poriën zijn relatief groot DNA/ RNA, grote & complexe eiwitten
Porie grootte is afhankelijke van de concentratie agarose
Polyacrylamide
Polyacrylamide gelen: uit acrylamide monomeren die covalent verbonden zijn via een crosslinker.
Chemische complex, maken en gebruik van deze gelen ook in vergelijking met agarose gelen
PAA gelen zijn stevig
Poriën in PAA gelen zijn relatief klein eiwitten en kleine oligonucleotiden
, SDS-Page
Functie componenten van de monsterbuffer:
SDS: een anionisch detergens en denatureert de 2de en 3de structuur en geeft een netto negatieve lading
aan alle eiwitten zodat ze dezelfde lading per massa hebben
B -mercaptoethanol of DTT: verbreekt de disulfide bindingen in de 3de structuur
Broomfenolblauw: zorgt ervoor dat eiwitten zichtbaar worden in de gel, bindt niet aan de eiwitten zelf
Glycerol: dient als loading buffer (voor verzwaring)
Koken: zorgt ervoor dat het gehele monster denatureert 8.3
Elektrode buffer
I
6.8
Stacking gel: TrisCL pH 6.8, 4% PAA Stacking gel
Running gel: TrisCL pH 8.8, 10% PAA
Monster buffer: TrisCL pH 6,8 Running gel 8.8
Electrode buffer: Tris glyci8ne pH 8.3
Langzame migratie voorkomt aggregatie van eiwitten
Concentrering geeft scherpe banden én hoge resolutie n
Isoelectrisch focusing (IEF)
Anode = positief trekt negatief aan
Elektroforese in een pH gradient
Kathode = negatief trekt positief aan
Focusing in 2 fases:
pH gradient wordt gevormd
Eiwitten bewegen naar anode als netto lading - is, anders naar de kathode als de netto lading + is
Eiwitten bewegen naar posities in pH gradient waar hun netto lading 0 is = pI
2D eiwit elektroforese
Deze methode wordt gebruik voor het scheiden van complexe mengsels van eiwitten en berust op 2
dimensies:
1 dimensie: isoelectrisch focusing (IEF) lading/ pI
·ee
2 dimensie: SDS-Page Mw
Hoge resolutie scheidingstechniek en kan tot 2000 eiwitten scheiden in 1 run
Analyseren is wel complex, je krijgt geen banden, maar ‘spots’ (X, Y coördinaten)
