Biotechnologie Blok 2 Jaar 2
Studiewijzer
DE LEERDOELEN
VOOR HET ONDERDEEL REGULATIE EN MODIFICATIE VAN GENEXPRESSIE KAN DE STUDENT:
• De mechanismen waarop de RNA-transcriptie, RNA-processing en RNA-translatie wordt
gereguleerd schematisch uitwerken aan de hand van een voorbeeld.
• Uitleggen hoe concentratieverschillen van regulerende stoffen leiden tot verschillen in
genexpressie en daarmee celdifferentiatie en –determinatie.
• Uitleggen op welke manieren horizontale genoverdracht en genetische modificatie plaats vindt in
de natuur bij prokaryoten.
• Uitleggen op welke manieren de mens genetische modificatie kan toepassen door gebruik te
maken van bij de in organismen voorkomende moleculaire mechanismen van horizontale
genoverdracht en CRIPSR-Cas9
• Een onderdeel van een experiment of een hypothese over de regulatie of modificatie van
genexpressie verder uitbouwen naar een experiment met positieve en/of negatieve controle en
een experimentele behandeling.
VOOR HET ONDERDEEL MERKER TECHNIEKEN MET ALLE BIJBEHORENDE STAPPEN EN HET
INTERPRETEREN VAN DE DATA UIT DEZE TECHNIEKEN KAN DE STUDENT:
• Uitleggen welke verschillende stappen nodig zijn bij moleculaire technieken vanaf het
verzamelen van de samples tot en met de resultaten van de moleculaire merker-techniek.
• Van twee sequentietechnieken uitleggen hoe de sequentie van een onbekende nucleotide
volgorde van een stuk DNA bepaald kan worden.
• Aan de hand van een gegeven werkwijze met een PCR en/of PCR-RFLP voorspellen welke
resultaten te verwachten zijn bij een gel-elektroforese.
• De student kan uitleggen hoe je variatie in het DNA of RNAzichtbaar kan maken met behulp van
de technieken: PCR-RFLP, microsatellieten, qPCR en ddPCR .
• De student kan uitleggen hoe je variatie in de genexpressie met de RNA-techniek en Microarray
en RNA-sequencing zichtbaar kan maken.
LEERMIDDELEN:
• Campbell Biology 12th edition: H18 (excl. 18.5) en H19
• Brock Biology of Micro-organisms, 16th edition:
o H6: deel I, II, III, IV3, deel V: H6.11
o H7: deel I: Introductie, H7.1 t/m 7.3; deel III, H7.8;
o H9: deel II: Introductie, H9.6 t/m 9.84
o H10: deel I: H10.2, DNA sequencing, deel II H10.8
o H12: deel I: H12.1 en H12.2, deel II: H12.6 en H12.7, deel III: H12.13
• Brock Biology of Micro-organisms, 15th edition:
o H4, deel III en deel IV (herhaling Campbell H17)
o H6, deel I
o H8.3 (figuur 8.7) en H8.7 (figuur 8.16) (ter introductie op H11)
o H9.6 (ter introductie op H11), H9.9 (eventueel ook 9.8: metagenomics?)
o H11 deel II Gene transfer in Bacteria, tot en met 11.8
o H12.1, H12.2, H12.6 en H12.7
• In de hoorcolleges aangehaalde bronnen op Blackboard.
1
,Hoorcollege 1
Regulatie van de gen expressie (epigenetica)
Reactiepaden (metabolic pathways) worden op verschillende manieren gereguleerd.
- Regulatie van de enzymactiviteit (snel): er vindt negatieve feedback
plaats op één van de enzymen in de keten, waardoor de
enzymatische activiteit afneemt.
- Regulatie van de genexpressie (langzaam): de enzymproductie wordt
van alle enzymen in de keten gereguleerd door negatieve feedback
op de genen die de enzymen maken.
Er zijn veel stappen bij de genexpressie. Genexpressie kan in alle
stappen, van DNA tot eiwit, de expressie reguleren. De mechanismen
betrekken bij de regulatie van de genexpressie worden epigenetische
mechanisme genoemd.
Regulatie chromatiden structuur.
Wanneer is een gen beschikbaar voor transcriptie en wanneer niet?
Belangrijke zaken hierbij zijn: DNAmethylering, histonmethylering en histonacetylering.
- Histonacetylering
Acetylering decondenseert het chromatine. Histonen (eiwitpakketje waar DNA omheen gerold is)
hebben staartjes waar groepen aan kunnen binden. Bij acetylering bindt een acetyl-groep (-CH3CO)
aan de histonenstaarten waardoor de positieve lading afneemt. Hierdoor wordt het DNA uitgerold
(euchromatine), het DNA is nu beschikbaar voor transcriptie.
- DNA- en histonmethylering
Methylering zorgt voor het condenseren van het chromatine. Bij methylering bind een methyl-groep
(-CH3) aan de histonenstaarten of aan het cytosine (nucleotide C) in het DNA. Door de binding stijgt
de positieve lading waardoor het DNA oprolt (heterochromatine)en de transcriptie niet meer
mogelijk is.
- Fosforylering
Bij fosforylering bindt een fosfaat-groep (-PO43-) aan de histonenstaarten. Door het binden van het
fosfaat wordt de methylering te niet
gedaan.
Al het DNA wat niet tot expressie moet komen zit opgerold, en is dus gemethyleerd.
De ontdekking van de beïnvloeding van chromatinestructuur door de modificatie van
histonenstaarten heeft geleid tot de ‘histon-code-hypothese’. Deze hypothese stelt dat er niet alleen
een code van A-T en C-G maar ook een code wat betreft de histonen en wanneer het DNA tot uiting
komt is.
Geslachtscelvorming
Bij geslachtvorming wordt de meeste methylering opgeheven. Het DNA wordt “gereset”. Maar niet
altijd: de overblijvende methylering is een voorbeeld van genomische inprenting. De markering is dan
epigenetische overerfbaar.
2
,Transcriptie regulatie
DNA-bindingseiwitten binden altijd op een stuk DNA met een
specifieke nucleotidevolgorde (bijv. TATA). Op deze bindingseiwitten
kan vervolgens RNA-polymerase II binden om de transcriptie te
beginnen. De bindingseiwitten zijn symmetrisch en koppelen op beide
strengen DNA. Dit doen ze op plekken met een omgekeerde herhaling
(inverted repeats). Bindingseiwitten zorgen voor een reactie op DNA,
bijvoorbeeld de transcriptie met RNA-polymerase of een blokkade voor
RNA-polymerase door een repressor.
Prokaryoten
- Negatieve controle algemeen
Negatieve controle is een mechanisme om de genexpressie te reguleren waarbij een repressor
transcriptie tegen werkt. Bij het blokkeren van de transcriptie, op wat voor manier dan ook, spreek je
van repressie. Repressie is het blokkeren van de aanmaak van een enzym als reactie op een signaal.
- Negatieve controle door co-repressie bij PROKARYOTEN
Er wordt constant een inactieve repressor gemaakt. De repressor wordt actief door de binding van
een co-repressor. Er is sprake van een onderdrukbare operon (repressible operon).
Een voorbeeld: het regulerende gen trpR maakt continu mRNA dat transleert in een inactieve
repressor, het trp operon transleert in een aantal enzymen. De repressor wordt actief met behulp
van een co-repressor, dit is één van de enzymen gemaakt door het trp operon. Wanneer de
repressor en de co-repressor samenkomen wordt het een actieve repressor die de transcriptie van
het trp operon tijdelijk blokkeert, waardoor de enzymen ook tijdelijk niet meer geproduceerd
worden. Op deze manier wordt de enzymproductie gereguleerd.
- Negatieve controle door inductie bij PROKARYOTEN
Productie van een bepaald enzym als reactie op bepaald substraat. Bij deze vorm van negatieve
controle wordt continu een actieve repressor gemaakt die de translatie blokkeert. De actieve
repressor wordt inactief wanneer een inducer (bepaalde substraat) aan de repressor bindt. Er is
sprake van een induceerbare operon.
3
, - Positieve controle bij PROKARYOTEN
Een mechanisme waarbij de genexpressie wordt gereguleerd met behulp van een activator eiwit. Dit
activator eiwit stimuleert de transcriptie. Het activator eiwit is inactief totdat het juiste substraat (de
inducer) er aanbindt.
Een voorbeeld: Een actief CRP-eiwit zorgt voor betere binding van RNA-polymerase aan de promotor
van het lac-operon. Het CRP-eiwit is een activator en wordt actief door het binden van cAMP
(inducer). cAMP ontstaat bij een glucose tekort waardoor het lac-operon alleen goed werkt bij weinig
glucose. Als er geen lactose is blijft repressie (=negatieve controle) optreden en heeft CRP-eiwit geen
invloed op transcriptie, dus alleen veel transcriptie bij weinig glucose en veel lactose.
Eukaryoten
De regulatie van de transcriptie bij eukaryoten lijkt op die van prokaryoten maar is complexer. Bij
prokaryoten heb je na een promoter meerdere genen (operon), bij eukaryoten heb je na een
promoter één gen. Dit ene gen bestaat uit meerdere exonen en intronen. Intronen worden later in
het proces er uit geknipt. Prokaryoten hebben geen intronen!
Ook hebben eukaryoten meerdere controle elementen op het DNA voor het gen, prokaryoten
hebben vaak maar één bindingsplaats voor een activeringseiwit (één controle element). De meerdere
controle elementen zijn nodig om de genexpressie bij verschillende celtypen precies te regelen. De
controle elementen kunnen distaal (ver weg) of
proximaal (dichtbij) ten opzichte van de
promoter liggen. Meerdere controle elementen
zitten soms samen in een “enhancher”.
4
