Chapter 5: DNA Replication and Repair
The maintaince of DNA sequences
Er zijn twee typen cellen en dat zijn de germ cellen en de somatische cellen. De germ cellen zijn de
geslachtscellen welke zorgen voor de overdracht van genen naar de nakomelingen. De somatische
cellen zijn alle andere lichaamscellen.
DNA replication mechanisms
DNA-polymerase is een enzym dat verantwoordelijk is voor het kopiëren van DNA-moleculen tijdens
DNA-replicatie, waarbij nieuwe DNA-strengen worden gesynthetiseerd op basis van een bestaande
sjabloonstreng. Tijdens de replicatie dienen beide strengen als een template voor een nieuwe streng.
De replicatie is semiconservatief. De replicatievork
is de plaats waar de DNA-replicatie plaatsvindt. Op
deze plek zit een multi-enzym die de DNA synthese
faciliteert. DNA-polymerase kan alleen nucleotiden
inbouwen van de 5’-3’ richting. De streng die de
andere kant op loopt, daar worden okazaki
fragmenten ingebouwd. De DNA streng die continue
kan worden gesynthetiseerd wordt de leading strand genoemd en de streng met okazaki fragmenten
is de lagging strand. DNA-polymerase doet ook aan proofreading wat eventuele fouten kan
herstellen.
De juiste nucleotide heeft een grotere affiniteit voor de bewegende polymerase dan een incorrecte
nucleotiden, omdat de binding dan energetisch gunstiger is. Nadat de nucleotide bindt, maar voordat
deze daadwerkelijk is toegevoegd aan de groeiende keten, ondergaat het enzym een comformatie-
verandering waardoor de grip strakker wordt rond de actieve plek. Dit zorgt ook voor een extra
controle mechanisme.
Exonuclease proofreading is een mechanisme dat wordt gebruikt door DNA-polymerase om fouten
in nieuw gesynthetiseerde DNA-strengen te corrigeren tijdens DNA-replicatie. Het houdt in dat de
DNA-polymerase de reeds gesynthetiseerde basen in de nieuwe streng controleert op juistheid
voordat er nieuwe basen worden toegevoegd. Hier is hoe exonuclease proofreading werkt:
1. Terwijl de DNA-polymerase nieuwe basen aan de groeiende DNA-keten toevoegt, kan het
soms een fout maken door een onjuiste base in te voegen.
2. Als een fout wordt gemaakt, kan de DNA-polymerase, als onderdeel van zijn exonuclease-
activiteit, achteruit bewegen (richting het 3'-uiteinde) langs de nieuwe DNA-streng om de
onjuiste base te detecteren.
3. Zodra de fout is gedetecteerd, zal de exonuclease-activiteit van de DNA-polymerase de
onjuiste base verwijderen door deze te knippen.
4. Vervolgens kan de DNA-polymerase de juiste base toevoegen op basis van de
complementaire basenparing met de sjabloonstreng.
RNA polymerase heeft dit mechanisme niet, omdat RNA niet wordt doorgegeven aan de volgende
generatie en fouten hebben geen lange termijn consequenties. RNA-polymerase is wel in staat om
RNA te maken in de afwezigheid van een primer, in tegenstelling tot DNA-polymerase.
DNA primase maakt kleine RNA primers die als startpunt fungeren voor de synthese van DNA. DNA
ligase verbindt de verschillende DNA fragmenten aan elkaar, met name bij de okazaki fragmenten.
,De RNA primers worden daarna weer verwijderd en aangevuld met DNA. DNA heeft de voorkeur,
omdat bij RNA de kans groter is op het ontstaan van foutjes, door de afwezigheid van de proof-
reading mogelijkheid. DNA helicase is een enzym dat verantwoordelijk is voor het openknippen van
een DNA streng. Dit wordt gedaan door de hydrolyse van ATP. DNA helicase beweegt in de 5’-3’ en
3’-5’ richting. Single-strand DNA-binding (SSB) proteins hebben als belangrijkste functie om
enkelstrengs DNA (ssDNA) te beschermen en te stabiliseren tijdens verschillende DNA-gerelateerde
processen in de cel. Ze binden zich specifiek aan enkelstrengs DNA-moleculen en vervullen diverse
rollen:
1. Bescherming van ssDNA: SSB-eiwitten voorkomen dat ssDNA wordt afgebroken of
beschadigd door endonucleasen of exonucleasen die anders ssDNA zouden kunnen
aanvallen.
2. Stabilisatie van ssDNA: SSB-eiwitten stabiliseren en voorkomen dat ssDNA zichzelf opvouwt
in secundaire structuren, zoals haarspeldlussen of gekoppelde basen, die de DNA-replicatie,
reparatie en recombinatie zouden kunnen verstoren.
3. Faciliteren van DNA-replicatie: Tijdens DNA-replicatie binden SSB-eiwitten zich aan de
enkelstrengs-DNA-template en houden het open en toegankelijk voor replicatie-enzymen
zoals DNA-polymerase, waardoor de vorming van nieuwe dubbelstrengs-DNA-moleculen
mogelijk wordt.
4. DNA-reparatie en recombinatie: SSB-eiwitten zijn betrokken bij DNA-reparatieprocessen en
homologe recombinatie. Ze helpen bij het stabiliseren en begeleiden van ssDNA tijdens deze
processen, waardoor correcte reparaties en recombinaties mogelijk zijn.
5. Bescherming tegen oxidatieve stress: SSB-eiwitten kunnen ssDNA beschermen tegen schade
veroorzaakt door reactieve zuurstofsoorten (ROS) tijdens periodes van oxidatieve stress.
DNA-polymerase dissocieert snel van de DNA streng af. Dit is gunstig bij het produceren van de
okazaki fragmenten, want hierdoor kan dit enzym snel hergebruikt worden. Bij het produceren van
langere stukken DNA op de leading strand is dit minder handig. Om dit makkelijker te maken is het
enzym sliding clamp aanwezig. Deze clamp zorgt ervoor dat DNA-polymerase aan de DNA streng
blijft zitten, maar laat meteen los zodra het weer een dubbelstrengs DNA stuk tegenkomt. Deze
sliding clamp is een soort ring dat om de DNA helix heen zit. De uiteindes van DNA-polymerase bindt
aan deze ring en zo kan het geheel over het DNA heen sliden. Dit kan alleen gebeuren door de
hydrolyse van ATP en daar is de clamp loader verantwoordelijk voor (deze laad de clamp). Op de
leading strand blijven deze eiwitten heel erg lang aan elkaar zitten. Bij de lagging strand wordt dit
complex ook gevormd, maar telkens als ze weer een stuk dubbelstrengs DNA tegenkomen laten ze
los. DNA-polymerase laat dan los van de clamp om vervolgens weer aan een nieuwe clamp te kunnen
binden bij het volgende okazaki fragment.
Strand-directed mismatch repair (SDR)
is een mechanisme in de cel dat
verantwoordelijk is voor het opsporen
en corrigeren van fouten in nieuw
gesynthetiseerd DNA tijdens DNA-
replicatie. Het doel van SDR is om
mismatch-fouten te herkennen en te
repareren die tijdens de replicatie
kunnen optreden, zoals onjuiste
basenparen of kleine inzet- en
deletiefouten.
,Hier is hoe SDR werkt:
1. Detectie van mismatch-fouten: Tijdens DNA-replicatie kan de DNA-polymerase soms een
verkeerde base invoegen, waardoor er een mismatch ontstaat, waarbij de nieuwe streng niet
goed overeenkomt met de sjabloonstreng. SDR begint met het opsporen van deze
mismatches.
2. Methylatiepatronen: In veel bacteriën wordt SDR begeleid door de methylering van het
DNA. De sjabloonstreng van het DNA is vaak gemethyleerd, terwijl de nieuw
gesynthetiseerde streng niet gemethyleerd is. Dit verschil in methylering helpt bij het
identificeren van de nieuw gesynthetiseerde streng.
3. Herkenning van nieuw gesynthetiseerde streng: De cel maakt gebruik van specifieke
eiwitten, zoals MutS en MutL bij bacteriën, om de nieuw gesynthetiseerde streng te
herkennen op basis van het methyleringspatroon. Deze eiwitten vormen een complex met de
DNA-mismatch.
4. Reparatie: Zodra de mismatch is gedetecteerd en geïdentificeerd, activeert het eiwitcomplex
verdere stappen om de fout te corrigeren. De fout kan worden verwijderd door
endonucleasen, en vervolgens wordt het juiste DNA-deel gesynthetiseerd door DNA-
polymerasen. Ten slotte wordt het gerepareerde DNA-streng gelijmd door ligasen.
SDR is een cruciaal mechanisme dat de nauwkeurigheid van DNA-replicatie handhaaft door fouten te
corrigeren die anders zouden kunnen leiden tot mutaties. Het komt voor in zowel prokaryoten als
eukaryoten, hoewel de details en de betrokken eiwitten kunnen variëren tussen deze groepen van
organismen. Het helpt bij het handhaven van de genetische stabiliteit en het voorkomen van de
accumulatie van fouten in het DNA, wat essentieel is voor het behoud van de genetische integriteit
van een organisme.
Een andere manier om de nieuw gesynthetiseerde lagging strand te
herkennen in eukaryoten is door te kijken naar de aanwezigheid van
nicks. Dit zijn kleine onderbrekingen in het DNA tussen de okazaki
fragmenten waar nog een kleine breuk tussen zit voordat ligase daar
langs gaat.
De replicatievork beweegt over het dubbelstrengse DNA en dat zorgt
voor het opdraaien van het DNA. DNA topoisomerase is
verantwoordelijk voor het ontdraaien van het DNA. Topoisomerase I
maakt een enkelstrengs breuk door de aanwezigheid van tyrosine op de
actieve plaats en haalt zo de spanning van de streng af. Daarna wordt
de breuk weer gerepareerd. DNA topoisomerase II maakt een
dubbelstrengs DNA breuk op plekken waar twee dubbele helixen elkaar
kruisen. Dit kost 2 ATP.
The initiation and completion of DNA replication in chromosomes
Speciale initiator eiwitten binden aan het dubbelstrengse DNA en
breken de waterstofbruggen tussen de basen. De plek waar dit plaats
vindt heet de replicatie origin. Vaak vind je op deze plek veel A-T
verbindingen, omdat hier minder OH-bruggen tussen zitten. Initiatie
kan alleen starten als de A’s gemethyleerd zijn en de initiator eiwitten
terug zijn naar hun ATP gebonden staat. Dit zorgt ervoor dat de
synthese van DNA niet achter elkaar kan doorlopen.
, Bij een prokaryoot zie je vaak maar één plek waar de replicatie begint. Bij eukaryoten heb je heel veel
plekken waar de replicatie start. Als dat niet zo zou zijn, dan zou de replicatie 35 dagen duren.
Tijdens de celcyclus vindt de replicatie plaats in de S-fase en deze duurt ongeveer 8 uur. In de M-fase
vindt dan de splitsing van de chromosomen plaats.
Als je het hebt over heterochromatine dan heb je het over sterk opgerold DNA (sterk
gecondenseerd). Het DNA is hier moeilijk toegankelijk voor de celmachines die genexpressie
reguleren. Euchromatine is de meer losse DNA structuur. Hierdoor is het DNA toegankelijker voor
transcriptiefactoren en andere eiwitten. Ook zie je hier vaak minder methylering. Heterochromatine
wordt laat in de S-fase pas gerepliceerd. Dit suggereert dat de mate van condensatie gerelateerd is
aan de timing van de replicatie.
De DNA sequenties die fungeren als de origine van replicatie bevatten een bindingsplek voor een
groot initiator eiwit dat meerdere subunits bevat (origin recognition complex, ORC). Het is ook rijk in
AT nucleotiden. Als je zoals bij eukaryoten zoveel plekken hebt om de replicatie te starten, hoe
reguleer je dan dat al het DNA gerepliceerd wordt? Om de replicatie te laten starten is er een soort
“licentie” nodig. Deze licenties worden verleend door eiwitcomplexen zoals ORC en deze worden
tijdens de celcyclus nauwkeurig gereguleerd. Deze licenties worden ook alleen afgegeven tijdens de
S-fase. Dit zorgt ervoor dat de replicatie ook maar één keer per celcyclus plaatsvindt. De processen
die aan de replicatie verbonden zijn worden zeer nauw gereguleerd.
Niet alleen het DNA moet gerepliceerd worden, maar ook de histonen moeten gemaakt worden. Dit
gebeurt ook in de S-fase. Histon mRNA is in deze fase met 50x toegenomen als resultaat van de
transcriptie en een verminderde afbraak van mRNA. Er is een feedback mechanisme aanwezig om
ervoor te zorgen dat er evenveel DNA als histonen wordt aangemaakt.
Histon chaperones zijn eiwitten die een essentiële rol spelen bij het beheer en transport van
histoneiwitten en hun interactie met DNA in de celkern. Histonen zijn eiwitten die verpakt zijn in DNA
om nucleosomen te vormen, de basisstructuur van chromatine. De belangrijkste functie van histon
chaperones is om histonen te helpen bij hun assemblage en disassemblage, wat cruciaal is voor
diverse processen zoals DNA-replicatie, transcriptie, DNA-reparatie en chromatinedynamiek. Hier zijn
enkele kenmerken en functies van histon chaperones:
1. Histone-assemblage en -disassemblage: Histonen zijn positief geladen eiwitten die DNA om
zich heen wikkelen om nucleosomen te vormen. Histon chaperones helpen bij de correcte
assemblage en disassemblage van deze nucleosomen. Ze kunnen histonen tijdelijk binden en
loslaten om de toegang van andere eiwitten, zoals DNA-polymerasen en transcriptiefactoren,
tot het DNA mogelijk te maken.
2. Transport van histonen: Histonen worden in de celkern gesynthetiseerd en moeten naar hun
bestemming in het DNA worden getransporteerd. Histon chaperones fungeren als
begeleiders die histonen naar specifieke DNA-locaties brengen waar ze nodig zijn voor
verschillende processen.
3. Regulatie van chromatinestructuur: Histone chaperones spelen een rol bij het dynamisch
reguleren van de chromatinestructuur. Ze kunnen histonen helpen bij het tijdelijk
ontspannen of compacteren van het chromatine, afhankelijk van de behoeften van de cel. Dit
is cruciaal voor de toegankelijkheid van het DNA voor replicatie, transcriptie en reparatie.
4. DNA-reparatie: Histon chaperones zijn betrokken bij DNA-reparatieprocessen, waarbij ze
helpen bij het verwijderen en vervangen van histonen rond DNA-schadeplaatsen.
