Moleculaire en biochemische technieken 2
Aantekeningen les week 1
Het doel is om met de IDH eiwitten aan de slag te gaan. De praktijkopdracht is om 500
microgram IDH te leveren. Het centrale dogma in de biologie is van DNA naar RNA naar
eiwit. Alle dingen in het lichaam worden uitgevoerd door eiwitten. We moeten achterhalen
waar de eiwitten zich bevinden. Het DNA bevindt zich in de celkern, het RNA wordt vanuit de
kern getransporteerd naar de ribosomen en in het cytoplasma. Voor de functie van het eiwit
is het van belang om te weten waar die eiwitten zitten. Tabel invullen.
Plasmide Eiwit Tag Eiwit Promotor? Eiwit Antibiotica
naam zuiveringsmethod expressie /
e inductie
bij?
pGEX GST-tag Glutatione Tac IPTG Amp
promotor
(omdat de
MCS na de
Tac zit en
hier dus je
IDH inzit), in
ons geval
willen we
dus de Tac
promotor
induceren.
2+
pBAS-HIS HIS-tag Affiniteit, Ni Ara Arabinose Amp
promotor
pET HIS-tag Affiniteit, Ni2+ T7-lac IPTG Amp
promotor
In alle gevallen gaan wij als zuiveringsmethode affiniteitschromatografie. Alle TAG’s hebben
een affiniteit voor iets anders. De histidine TAG hebben een affiniteit met nikkel. GST heeft
affiniteit met glutatione. We gaan een fusie-eiwit maken. Dus we krijgen TAG-IDH.
GFP is handig, ligt aan de toepassing. GFP gebruik je om te kijken waar een eiwit zich
bevindt. De HIS, FCAG, GST gebruiken we om te zuiveren.
pGEX map. AMPr, is de resistentie tegen het antibiotica ampicilline. Het gen heet het bèta
lactamase gen en deze zorgt voor de ampicilline resistentie. Ori, zit er niet voor de replicatie
van de bacterie, maar voor de replicatie van het plasmide. In de multiple cloning site zitten
heel veel restrictiesides. We hebben verschillende varianten pGEX 4T-1, 4T-2 en 4T-3. Er is
een verschil met de stopcodons. Soms zijn het er meer. Dit is voor het openreading frame.
Dus je hebt eerst je TAG, dan knip je met EcoR1 en Xho1, hiertussen komt de genetische
informatie van je IDH. Nu is de vraag waar is het stopcodon? Waar houdt hij op met het
vertalen van aminozuren. Hij zit aan het einde van de genetische informatie van IDH.
Startcodon zit voor de TAG. In de ideale situatie haal de het startcodon van IDH weg. Het
ideale is dat de aminozuren van de TAG door blijven lopen in de condons van IDH. Maar dat
is niet altijd vanzelf zo. Hij moet netjes doorlopen tussen die twee. Soms scheelt het 1, 2 of
3. De IDH krijgt stopcodons van IDH en stopcodons van de lege vector. Stopcodons kan je
nooit genoeg hebben. Nog uitleg krijgen over hoe dit precies zit, hoe die stopcodons aan het
einde van de IDH en in de lege vector hier aan bijdragen en dit probleem verhelpen. Tevens
staat er in de vector map, trombine. Trombine zit tussen de aminozuren Arginine en Glycine.
De trombine zit net voor de multiple cloning site. In je multiple cloning site ga je je IDH
zetten. Je trombine zit dus tussen je TAG en je IDH. Trombine is een enzym en deze knipt
het eiwit, het is een protease. De functie ervan is dat je je TAG er weer af kan knippen.
,Medicijnen worden ook op deze manier gemaakt, dus het is handig om je TAG er weer uit te
kunnen knippen want je wil bijvoorbeeld geen GFP in je medicijn hebben.
Zuivering pGEX. We weten dat de pGEX, een GST-TAG heeft en deze bindt dus aan
glutathione. Je hebt dan je IDH met die GST-TAG eraan en deze spreid je over je kolom uit.
Alles wat we van de bacterie hebben gooien we over die kolom. In het lysaat van de bacterie
zitten dus al de eiwitten van die bacterie. Als het goed is blijft de IDH aan de kolom hangen
(dit komt door die GST-TAG). In de kolom zit in dit geval de glutathione. IDH blijft plakken en
wat eruit komt wordt de flow through. Van het lysaat voer je voordat je hem op de kolom doet
een SDS page uit. Je zal heel veel bandjes zien. Als je goed geïnduceerd hebt dan zie je een
heel dik bandje bij de hoogte van IDH. Je IDH blijft daarna dus aan de kolom plakken en de
rest loopt door de kolom. Toch blijven er nog heel veel andere eiwitten stiekem aan de kolom
plakken, je moet dus ook nog wassen. Als de kolom 100% goed zou zijn zou er bij de was
stap niks meer uitkomen. Je zal dus een paar keer moeten wassen. Je moet drie keer
wassen om alle eiwitten eruit te krijgen. De laatste stap is het elueren. Als het goed is loopt
dan alles er weer door. Je krijgt dat je elutie fractie. Als het goed is zit hier alleen je IDH in.
Dit doe je ook drie keer. Uiteindelijk heb je dus je IDH eiwit en die ga je behandelen met
trombine. Dan krijg je twee eiwitten en die moet je weer verder zuiveren. Op de afbeelding is
de eerst een fractie die niet geïnduceerd is. De tweede is de fractie die wel geïnduceerd is, je
ziet hier ook een heel dik bandje rond de grootte van IDH (deze is dus in over-expressie
gebracht. De derde is de flow trough, hier verwacht je geen IDH (kunnen natuurlijk wel
eiwitten ter grootte hiervan zitten). Daarna heb je drie was-stappen en hier zal je steeds
minder eiwitten tegen komen. Daarna heb je de elutie en dan komt je IDH, met die TAG en
gebonden aan die glutathione.
Wat we hebben is het kolom materiaal (links op afbeelding), GST zit dus aan het eiwit. Hoe
krijgen we het eiwit (IDH+TAG) weer van de kolom eraf? Het is lastig om die affiniteit weg te
halen. Je gaat losse glutathione toevoegen, dan gaan ze een competitie aan en gaat je IDH
ook aan de losse glutathione zitten. Dit is de elutie die plaatsvindt.
Zuivering pET. Bla coding sequence, is de bèta lactamase coding sequentie. Dus hier zit
de antibiotica resistentie. Ze noemen hem bij de pET AP, hier zit dus de antibiotica
resistentie. Als je die vector uitschrijft zie je er opeens aminozuren boven staan (boven de
DNA code). Je ziet eerst een sequentie, daarna zie je er aminozuren boven en dan weet je
dat hij begint met aflezen. Hij geeft dan netjes aan welke aminozuren er gemaakt worden. Je
ziet dat de trombine in het eiwit knipt. Je ziet eerst je HIS-TAG, dan de trombine en dan de
MCS, dus je kan de TAG er uiteindelijk weer afknippen.
Onderstaande afbeelding moet je goed weten. Dit is een BL21 cel. Links zie je het eigen
genoom van de bacterie. Deze heeft hij altijd, alleen als het een BL21 (DE3) is, dan heeft hij
het stukje DE3 in zijn genoom zitten. Deze DE3 heeft het T7 gen die als hij tot expressie
komt, het T7 RNA polymerase maakt. Hiervoor zit echter de Lac operator. Het LacI gen die
maakt zo een eiwit die op de Lac operator gaat zitten en dan komt de T7 RNA polymerase
niet tot expressie. Als je zo een pET vector in de BL21 cel doet met de DE3, dan heeft de
BL21 cel dus ook de pET vector. De T7 RNA polymerase (die de B21 cel dus zelf produceert
vanuit zijn eigen genoom), is nodig om de T7 promotor tot expressie te brengen die zich in
de pET vector bevindt. Echter wordt deze T7 promotor ook heel de tijd onderdrukt door de
Lac operator in de pET vector. Als er inductie van IPTG is, dan werkt hij op twee plekken.
Dus hij werkt op het genoom van de BL21 cel en op de pET vector. Nu kan T7 RNA
polymerase wel tot expressie worden gebracht en zijn werk doen doordat de IPTG de
eiwitten van vorm veranderen en daarom kunnen deze niet meer binden op de Lac operator.
De BL21(DE3)pLysS die heeft nog een extra plasmide, namelijk de pLysS. Er is altijd wat
achtergrond expressie van de T7 RNA polymerase. De pLysS in de BL21 cel die heeft het T7
lysozyme gen en die codeert voor het T7 lysozyme. Het T7 lysozyme die zorgt ervoor dat die
kleine achtergrond expressie (de kleine hoeveelheid expressie van T7 RNA polymerase)
inactief wordt gemaakt. Dit is dus een extra eigenschap (dan is er dus helemaal geen T7
RNA polymerase en dat wil je ook niet want je wil hem niet tot expressie brengen). Pas als je
, IPTG induceert, dan wordt T7 RNA polymerase in over expressie gebracht. Als hij in over
expressie wordt gebracht dan wordt de functie van het T7 lysozyme teniet gedaan en kan T7
RNA polymerase gewoon zijn werk doen. Dus hiermee kan je precies regelen wanneer je je
gen tot expressie brengt. Als je IPTG induceert dan zet je hem aan en als IPTG er niet is dan
is er ook geen achtergrond expressie en is hij dus helemaal uit. Dus pLysS knipt de T7 RNA
polymerase omdat we willen voorkomen dat het eiwit tot over-expressie komt. We willen
ervoor zorgen dat als er geen IPTG is dan er helemaal geen T7 RNA polymerase is. Er is
een mechanisme ingebouwd dat als er een beetje T7 tot expressie komt dat dit dan wordt
afgebroken.
Zuivering pBAS-HIS. pBAD is de BAD promotor. ATG is het startcodon. 6 * HIS is de TAG.
EK site is de enterokinase, deze heeft dezelfde functie als trombine. Deze EK site zit weer
voor de MCS. De pijlen wijzen verschillende richtingen op. Op het plasmide zit verschillende
informatie en die hebben hun eigen richting. AraC is voor de arabionose, deze induceren we
namelijk met arabinose. De structurele genen hebben we eruit gehaald en daar komt ons
IDH te zitten. Er ontstaat een AraC polypeptide en hier kan anabinose aan gaan binden.
Zonder arabinose vouwt je DNA dubbel. Met arabinose komt de promotor wel beschikbaar
omdat hij de vorm van het AraC polypeptide verandert die voor die dubbelvouwing zorgde.
Aantekeningen werkbespreking
Het uitgangsmateriaal is de BL21 cel met de pGEX vectoren en de insert (mutant of
wildtype). We gaan hem vervolgens eerst opkweken in een kolf in een grotere hoeveelheid,
daarna gaan we hem induceren. Tijdens de inductie gaan we de vector aanzetten, dit ga je
doen met arabinose of IPTG (afhankelijk van je type vector). Op het moment dat het gen
wordt geïnduceerd, wordt het eiwit IDH geproduceerd. Het GST of het HIS wordt tevens erbij
afgeschreven. Deze zit voor de IDH. Je krijgt dan IDH of fusie eiwit. Het IDH zit in de cel,
vervolgens moet het eiwit dus geïsoleerd worden. De cel moet dan kapot gemaakt worden
door middel van ultra sonificatie. Hierna wordt er een controle uitgevoerd om te achterhalen
of we überhaupt eiwit hebben (om te kijken of de ultra sonificatie niet al het eiwit kapot heeft
gemaakt). Dit doe je door een SDS-page uit te voeren. Vervolgens dient het eiwit gezuiverd
te worden met behulp van een kolom. Je wil nu achterhalen in welke fractie je eiwit zit (hierbij
zet je weer een gel in om de grootte te bepalen). Je hoopt dan te zien dat in de ene fractie
wel een bandje zit en in de andere niet. Hierna moet je een eiwit bepaling doen, dit kan via
