Moleculaire biologie course 5
Aantekeningen les week 1
Onderzoek naar fruitvliegjes wees uit dat chromosomen genetisch materiaal bevatten.
Chromosomen bevatten eiwitten en DNA. Eiwitten bestaan uit 20 verschillende aminozuren
(monomeren). Eiwitten zijn veel complexere moleculen dan DNA. Bij DNA is er dus veel
minder variatie mogelijk. Eiwitten hebben 20 monomeren (aminozuren) en DNA maar 4
monomeren (nucleotiden). Bij mensen zie je veel variatie daarom dachten ze dat het
genetische materiaal ook wel eens eiwitten konden zijn.
Het onderzoek van Hershey and Chase 1952, is een onderzoek met bacteriofagen (zijn
virussen in bacterie). Virussen stoppen iets van zichzelf in bacteriecel. Wat virus in bacterie
stopt, moet wel erfelijk materiaal zijn. Proef 1 eiwit radio actief labelen, proef 2 fosfaat
radioactief labelen (zit in DNA). Bacteriën hebben ze laten besmetten met fagen en
vervolgens bacterie van fagen scheiden. Uiteindelijk kwam eruit dat DNA het erfelijk
materiaal is.
Een belangrijk onderdeel van DNA zijn de pentose suikers. Verschil tussen deoxyribose
(DNA) en ribose (RNA) moet je kennen, ribose heeft een O extra. Je moet weten hoe dat
pentose suiker eruit ziet.
DNA bestaat ook uit verschillende basen (vier verschillende monomeren). Purines bevatten
twee ringen, onder de purines vallen adenine (A) en guanine (G). De pyrimidines bevatten
,één koolstofring hieronder vallen cytosine (C) en thymine (T) (of uracil (U) in RNA).
Nucleïnezuren bestaan uit een base, een suikergroep en een fosfaatgroep. De bovenste
fosfaatgroep zit vast een de vijfde C van het suikermolecuul. Daarna zit de volgende
fosfaatgroep weer vast een de derde C. De stikstofbase zit aan de binnenkant. Aan het 5’ C
van de suiker zit de fosfaatgroep, aan de 3’ C van het suiker worden de nieuwe nucleotiden
toegevoegd. De verbinding tussen alle verschillende nieuwe nucleotiden heet de fosfodi-
esterverbinding. In DNA en RNA vormt de fosfodi-esterbinding een binding tussen het 3'
koolstofatoom van de ene (deoxy)ribosesuiker en het 5' koolstofatoom van het andere
(deoxy)ribosesuiker. Aan het derde koolstofatoom (dus 3’ einde) wordt telkens een nieuw
nucleotiden toegevoegd. De backbone van het DNA bestaat uit suikers en fosfaatgroepen.
Het verschil in nucleotiden maken de bases. Als je een DNA sequentie opschrijft schrijf je
hem op van 5’ naar 3’, omdat je aan het 3’ einde nucleotiden toevoegt (altijd).
De structuur van DNA is een dubbele helix. Uitvinding van die structuur vond plaats door
Watson and Crick (1953). Rosalind Franklin (1952) heeft hier een hele belangrijke rol bij
gespeeld doordat ze de X-ray diffraction pattern bedacht. Dus vooral dankzij haar weten we
hoe het DNA eruit ziet. Aan de binnenkant van de dubbele helix zitten de basen. Om en om
heb je een minor groove (kleine opening) en een major groove (grote opening). Relevantie
hiervan is dat sommige stoffen hier wel of niet inpassen. Je hebt dus twee polymeren die met
elkaar verbonden zijn. De verbindingen zitten tussen de basen (waterstofbruggen). Tussen A
en T zijn het er twee waterstofbruggen en tussen C en G zijn het er drie waterstofbruggen.
Als je naar een PCR reactie kijkt kost het dus meer moeite (hogere temperatuur), om C en G
van elkaar los te maken, dan A en T omdat deze drie waterstofbruggen onderling vormen.
Het semiconservative model is het juiste model voor DNA replicatie. DNA chain elongatie.
De template streng op de afbeelding is blauw en de nieuwe is roze. Het oorspronkelijke DNA
wordt dus als template gebruikt. Mensen hebben lineaire chromosomen en bacteriën hebben
circulair DNA. De replicatie gaat dan ook op een andere manier. Bij het verdubbelen van het
DNA worden er nieuwe nucleotiden toegevoegd. De nucleotiden worden toegevoegd aan het
derde C atoom (3’ einde). Dat nieuwe nucleotiden heeft een veel grotere fosfaatgroep (meer
fosfaatgroepen), dan een normaal nucleotiden. Om deze reden komt er dan nog een
pyrofosfaatgroep vrij. De nieuwe streng groeit dan ook van 5’ naar 3’.
Voor zowel lineair en circulair DNA zit er een herkenningspunt die betrokken zijn bij de
initiatie, dit is een belangrijke herhaalde sequentie voor de eiwitten. Deze eiwitten zijn
enzymen die een helicase activiteit hebben (deze kan het DNA ontwinden). Ze zorgen dat er
ruimte vrij komt voor de replicatie. Je kan dan aan beide kanten het DNA verdubbelen (er
ontstaat dan aan beide kanten een replicatiefork). Allebei de andere kant op want moet altijd
van 5’ naar 3’. DNA primase begint met de daadwerkelijke replicatie, deze zet er een primer
aan (= een RNA primer). DNA polymerase 3 voegt vervolgens de nieuwe nucleotiden toe.
Waar dat gemakkelijk gaat noemen we de leading strand. Waar dat moeilijker gaat noemen
we de lagging strand. Je kan alleen aan het 3’ einde van het NIEUWE DNA nucleotiden
toevoegen. Single strand DNA binding proteins zorgen ervoor dat het DNA tijdelijk
enkelstrengs blijft (dus niet gelijk weer een dubbele helix wordt). De fragmenten bij de
lagging strand worden Okazaki fragmenten genoemd. Bij de lagging strand, haalt DNA
polymerase 1 de RNA primer helemaal weg en vervangt het door DNA. DNA ligase verbindt
de losse fragmentjes met elkaar. DNA ligase herstelt een fosfodi-esterbinding.
* Primase zet de primer erop in de in de 5’ naar 3’ richting. Dat noem je een 5’ naar 3’
polymerase activiteit.
* DNA polymerase 3 heeft net als primase een 5’ naar 3’ polymerase activiteit. DNA
polymerase 3 heeft ook een 3’ naar 5’ exonucleoase activiteit.
* DNA polymerase 1 heeft eerst ook nog een weghaal activiteit van 5’ naar 3’ exonuclease
activiteit. DNA polymerase 1 heeft ook een 5’ naar 3’ polymerase activiteit.
* DNA ligase heeft een 5’ naar 3’ polymerase activiteit.
DNA polymerase 3 heeft een hele belangrijke eigenschap want hij heeft een proofreading
functie. Als je nagaat hoe vaak het DNA wordt verdubbeld dan is dat 60-90 nucleotiden/sec.
Bij 1 per 100000-1000000 nucleotiden gaat het mis. In het menselijk genoom heb je 3*10^9
,nucleotiden. DNA polymerase 3 controleert dus steeds zijn eigen werk. Als dat gebeurt is zit
er nog maar 1 fout per 10^9 basepenparen in het DNA. Bij een circulair molecuul start de
replicatie op één plek, dit wordt theta replicatie genoemd. Bij lineaire moleculen zijn er
meerdere plekjes waar de replicatie start, niet allemaal tegelijkertijd (ze starten na elkaar en
kunnen dus nog wel tegelijk bezig zijn). Uiteindelijk komen al die replicatieforken weer bij
elkaar en krijg je een nieuw DNA molecuul. Waar de replicatie begint noem je de origins of
replication. Bij een bacterie heb je dus één origin of replication en bij lineair DNA heb je er
dus heel veel. Aan het einde van de lagging streng van een lineair DNA molecuul heb je een
probleem omdat het uiteinde een 5’ einde is en kan dus niet opgevuld worden. Je kan
namelijk alleen aan het 3’ einde nucleotiden toevoegen. Dus eigenlijk bij iedere replicatie, bij
lineaire chromosomen, wordt het DNA een stukje korter. Om deze reden zitten er aan de
uiteinden telomeren die geen erfelijke informatie bevatten. Een lichaamscel heeft een
bepaalde levensduur, dit heeft te maken met het korter worden van de telomeren.
Stamcellen, kankercellen en geslachtscellen hebben hier iets op gevonden. Deze hebben
een enzym die ervoor kan zorgen dat je het stukje toch opgevuld kan worden (enzym is
telomerase). Telomeren bestaan uit een herhaalde DNA sequentie, bij de mens is dat
TTAGGG. Het heeft geen gevolgen als daar een stukje vanaf gaat omdat deze sequentie
geen erfelijke informatie bevat. De telomeren zitten dus aan het einde van de chromosomen.
Normale lichaamscellen (somatische cellen) hebben geen telomerase, alleen dus de
bovengenoemde cellen. Tumorcellen hebben een trucje gevonden om telomerase te maken.
Filmpje legt uit wat telomerase doet. De sequentie TTAGGG wordt herkent. Telomerase
heeft een RNA template, deze heeft een capaciteit met reverse transcriptase. Dit betekent
dat hij een kopie van RNA naar DNA kan maken. Het uitstekende 3’ einde gaat hij eerst
verlengen. Hij gebruikt de template streng om te herkennen en dan gaat hij verlengen. Dat
doet hij een paar rondes tot er weer ruimte is voor een primer zodat DNA polymerase weer
nieuwe nucleotiden kan toevoegen. Het extra stukje wat er dus aan vast is gemaakt is alleen
maar gedaan om een primer om te binden.
Dus de enige manier dat een cel een langere levensduur kan hebben is door telomerase tot
expressie te brengen. De vraag is als andere cellen dat kunnen doen, of we dan ook ouder
kunnen worden? Is een best belangrijk onderzoek gedaan tegen veroudering. Onderzoek
met muisjes die dusdanig zijn veranderd zodat ze telomerase tot expressie brengen. Dan
vergelijken met wildtype. Muizen worden ongeveer 2 jaar oud. 40% van de muizen leeft
langer met het enzym telomerase. Dan nog kijken hoe fit die ouder geworden muisjes zijn.
Als wildtype muisjes aan het einde van hun leven zijn lukte het niet om over een koortje te
lopen, de gemuteerde muisjes wel rond die leeftijd.
Aantekeningen les week 2
Het bacteriële genoom (bijvoorbeeld e. coli) bevat 4,6*106 basenparen. Het humane genoom
bevat 3*109 basenparen. Het bacteriële genoom bestaat uit één circulair chromosoom 90%
hiervan codeert voor eiwit. Het humane genoom bestaat uit 46 lineaire chromosomen en
slechts 1% codeert voor eiwit. Genetische variatie bij bacteriën. Kan door mutaties
(chemisch UV). Horizontale gentransfer (genetische informatie kan van de ene bacterie naar
de andere gaan).
1. Conjugatie. Echter fysieke verbinding tussen twee bacteriën.
2. Transductie. Genetische informatie overbrengen door bacteriofaag.
3. Transformatie. DNA komt vrij doordat de donor cel kapot gaat. De stukjes DNA van de
donor cel kunnen dan in een ontvanger terecht komen.
, Proef. Je kan een selectie van een voedingsbodem doen, waarop de ene bacterie wel kan
groeien en de andere niet. De beschrijving onder de afbeelding zegt iets over het genoom
van de bacterie. – betekent dat ze het aminozuur niet kunnen maken en + betekent dat ze
het aminozuur wel kunnen maken. Alleen op die vijf genen (die coderen om die aminozuren
te maken), verschillen ze. In het experiment worden beide stammen samengevoegd. Als je
ze dan op een plaat doet met ontbrekende aminozuren verwacht je dat ze niet kunnen
groeien. Als er wel kolonies ontstaan hebben ze genetisch materiaal van elkaar gekregen.
Conclusie tweede experiment is dat de bacteriën alleen genetisch materiaal door kunnen
geven als ze met elkaar in contact kunnen komen.
Homologe recombinatie. In de meiose gaan de chromosoom paren naast elkaar zitten en de
chromosoomparen worden uit elkaar getrokken. Op het moment dat ze nog paarsgeweis
liggen kan er homologe recombinatie door crossing over plaatsvinden. De chromosomen zijn
identiek (zelfde gen), maar ene zegt bruine ogen, de andere zegt blauwe ogen. De
sequenties zijn homoloog, lijken op elkaar en dan kunnen ze dus uitwisselen. Hierdoor
ontstaat er weer genetische variatie. Dit kan gebeuren zolang er sprake is van homologie
(veel gelijkheid). De sequentie lijkt dus sterk op elkaar en ze kunnen dus onderling informatie
uitwisselen.
Conjugatie. Sommige bacteriën kunnen pillie vormen, ze kunnen dan een andere bacterie
aanraken en een andere bacterie naar zich toehalen (er ontstaat een buisje). Er vormt zich
dan een cytoplasmabrug tussen twee bacteriën. F+ bacteriën hebben een F factor en die
kunnen uitsteeksels maken en dus contact maken met een andere bacterie. Een F factor is
eigenlijk een soort plasmide (in dit geval noemen we dit plasmide een episoom). Episomen
zijn plasmiden die instaat zijn om te integreren in het bacteriële chromosoom, een voorbeeld
hiervan is de F factor. Dus een F factor is extra chromosomaal genetisch materiaal met een
voordeel erop (bijvoorbeeld antibioticaresistentie).
Plasmide. Als je naar een bacterie kijkt heb je het genoom, buiten zijn genoom kan hij nog
andere DNA fragmenten hebben, dit zijn plasmiden. Deze plasmiden kunnen over
eigenschappen beschikken die niet persé essentieel zijn voor de bacterie om te kunnen
overleven. Meestal zijn ze circulair en spelen een rol in de levenscyclus en groei. Ze hebben
1 ORi en in bijvoorbeeld een e. coli bacterie komen 270 verschillende plasmiden voor. De
ene bacterie is F+ en de andere is F-. Hele genetische stukje kan in de andere bacterie
terecht komen. Hierdoor andere bacterie ook F+. Het genoom verandert dan niet.
Transfer of bacterial genes. Het kan ook zo zijn dat er crossing over door homologe
recombinatie plaatsvindt, het gevolg hiervan is dat je niet een apart episoom hebt maar dat
zo een F factor het in het genoom terecht is gekomen. Dan is het een Hfr cel = high
frequentcy reombination (F factor in genoom). Deze cel kan nog steeds de F factor
doorgeven, maar dan wordt er ook een gedeelte van het genoom doorgegeven (een deel
van de F factor wordt dan doorgegeven met bijvoorbeeld een gen). Wanneer er dan
homogene recombinatie plaatsvindt, kan de bacterie bijvoorbeeld resistent worden. Groene
gedeelte is het gen die codeert voor een positief aminozuur. Via homogene recombinatie is
het dus het zwarte gen geworden. Het lineaire DNA dat na de conjugatie overblijft wordt
afgebroken (F factor wordt dus afgebroken). De ontvanger blijft dan F-.
Tijdens de verbinding wordt een stukje van het F factor doorgegeven en een stukje van het
genoom. Dit stukje van het genoom (groene stukje is homoloog aan zwarte stukje gen). Als
nu de F factor wordt doorgegeven via conjugatie, gaat er ook iets van het genoom mee (dit
stukje DNA wordt enkelstrengs doorgegeven). Als het enkelstrengs DNA de ontvanger
bacterie bereikt, dan wordt het verdubbeld. Het groene gen is dan dus ook meegekomen.
Deze is weer homoloog aan het zwarte gen en dan kan er homologe recombinatie
plaatsvinden. Dan is het gen in het genoom van de ontvanger gebouwd. Omdat het lineair
DNA is wat van de donor bacterie naar de ontvanger bacterie is gegaan, wordt dit
afgebroken in een bacterie. De ontvangende bacterie is niet F+ geworden want die F factor
is afgebroken (omdat die F factor zich in het lineaire DNA bevindt en niet is uitgewisseld via
homologe recombinatie). Omdat dit meestal een overlevingsfactor (groene gen) is zal deze
