Samenvatting Studentencursus - Proteïnechemie, functie en structuur (4016677ENR)
23 keer bekeken 1 keer verkocht
Vak
Proteïnechemie, functie en structuur (4016677ENR)
Instelling
Vrije Universiteit Brussel (VUB)
Uitgebreide studentencursus (175 paginas) van het vak Proteïnechemie, functie en structuur (4016677ENR) gegeven door Prof. W. Versées en Prof. Remy Lorisin in de 1MA bio-ingenieurswetenschappen aan de Vrije Universiteit Brussel.
,1. Chemische eigenschappen van aminozuren en polypeptiden
1.1. Probleemstelling
Om aan te tonen waarom het relevant kan zijn om de chemische eigenschappen van aminozuren en
polypeptiden te bestuderen stellen we het volgende probleem: we hebben twee eiwitten MnmE en
MnmG (beiden dimeren) die betrokken zijn in de modificatie van tRNA met een methylaminomethyl
(mnm) groep op de wobble-positie1 waarbij complexvorming van de twee dimeren vereist is. Echter
bindt dit complex met lage affiniteit, wat het moeilijk maakt om dit complex in een kristalrooster vast
te leggen. Om aan structuurbepaling van het complex te doen zullen we een strategie moeten bedenken
om een stabiel complex te vormen. We proberen zo eigenlijk het evenwicht meer te verschuiven naar
het complex vergeleken met de subunits apart, dewelke vaak wordt weergegeven met een
dissociatieconstante KD.
Side note: één van de domeinen van MnmE zelf is ook een molecular switch dat GTP in GDP omzet en
afhankelijk van de gebonden vorm een andere conformatie aanneemt (‘allosterisch eiwit’).
1.2. Nanobodies as crystallization aids (ChILL & DisCO)
Belangrijk om te begrijpen is dat tijdens eiwit-eiwit interacties vaak conformationele wijzigingen
plaatsvinden. De aparte subunits ondergaan wijzigingen om zo beter in elkaar te passen/zo veel
mogelijk gunstige interacties aan te gaan. Gunstigeobodies/antilichamen te gebruiken die specifiek
gunstige interacties aangaan met het complex, zullen de gebonden complexen niet meer terugreageren
en zo uit het evenwicht gehaald worden. Volgens het principe van Le Châtelier zal het evenwicht dit
compenseren door naar het complex te verschuiven. Meestal zullen nanobodies en antilichamen binden
op epitopen die niet voorkomen in de vrije keten → zo zal het complex gecrosslinked worden en op die
manier uit het evenwicht gehaald worden (kan niet meer terugreageren).
1
De wobble-positie is het derde nucleotide in een codon, waarbij interactie tussen tRNA en mRNA niet
via de standaard (sterke) Watson-Crick baseparing gebeurt (A – T en G – C) maar via andere, minder
sterke interacties
,Echter moeten we om nanobodies/antilichamen te verkrijgen die binden met het complex, immuniseren
met het complex zelf waar we net over hebben verteld dat het onstabiel is. Dit wordt verder bemoeilijkt
door het feit dat we het complex verdunnen door deze in te spuiten in het bloed van het dier waar we
in immuniseren (toename in volume betekent een verschuiving van evenwicht naar de aparte subunits
volgens Le Châtelier).
Dit complex kunnen we initieel verkrijgen door de subunits chemisch te crosslinken. Hiervoor is het
cruciaal om de chemie van aminozuren & eiwitten te begrijpen → doel van dit hoofdstuk. De reden dat
we niet direct dit chemisch gebonden complex kunnen gebruiken is dat we altijd onzuiverheden hebben
(bv. crosslinks op verkeerde plaatsen, tussen de verkeerde subunits etc.).
Deze techniek om stabiele complexen te verkrijgen wordt ook ChILL & DisCO2 genoemd en is
ontwikkeld aan de VUB door de groep van Jan Steyaert
Een andere optie om stabielere complexen te vormen is om mutagenese te doen om het oppervlak van
interactie (bv. waar afstoting plaatsvindt tussen twee Arg, één vervangen door Glu/Asp om een gunstige
ionische interactie te verkrijgen) → Om dit gericht te doen moet echter de structuur van het complex a
priori gekend zijn. Ad random mutagenese bv. via phage display is dan andere mogelijke oplossing.
1.3. De 22 proteïnogene aminozuren
Vaak worden de gekende 20 aminozuren weergegeven als de enige aminozuren die in eiwitten
voorkomen. In de realiteit zijn er echter 22 proteïnogene aminozuren. De aminozuren die vaak worden
weggelaten zijn Selenocysteïne en Pyrrolysine (structuren niet te kennen).
1.3.1. Selenocysteïne (Sec, U)
Selenocysteine wordt slechts verwerkt in een 5-tal eiwitten in de mens. Daar speelt het een rol in de
bescherming tegen oxidatieve stress wat Se een belangrijk micronutrient maakt voor mensen. We
hebben in het verleden gezien dat alle codons al toegewezen zijn aan bepaalde aminozuren, maar hier
kan doormiddel van specifieke herkenningsmechanismen een stopcodon gebruikt worden om Sec in te
bouwen in plaats van de normale herkenning als stopcodon.
2
Cross-link PPIs and immunize llamas & Display and co-selection
,1.3.2. Pyrrolysine (Pyl, O)
Pyrrolysine is niet aanwezig in mensen, maar wél in bepaalde methanogene archaea zoals
Methanosarcina barkeri. Het aminozuur kent toepassingen in de synthetische biologie (later meer) en
gebruikt in de natuur als anticodon ook een stopcodon om ingebouwd te worden door tRNA.
Regulatiemechanismen ervoor dat niet bij elk stopcodon een Pyl wordt ingebouwd.
1.3.3. Glycine (Gly, G)
Glycine en Proline vormen een uitzondering op de algemene structuurformule van aminozuren. Glycine
heeft als “substituent” een waterstof, wat ervoor zorgt dat de Cα geen 4 verschillende substituenten
heeft en de molecule dus achiraal is.
1.3.4. Proline (Pro, P)
De alifatische zijketen van Proline vouwt terug op zichzelf. De amino-groep in de backbone heeft
daarom één waterstof minder, wat implicaties heeft voor de reactiviteit en compatibiliteit in secundaire
structuren (zie later)
1.4. De chiraliteit van aminozuren
Alle aminozuren behalve glycine zijn chiraal. Er zijn 2 nomenclatuursystemen die doorgaans worden
gebruikt voor chiraliteit, waarvan één meestal voor aminozuren.
1.4.1. Cahn-Ingold-Prelog systeem (R)/(S)
Deze nomenclatuur wordt eigenlijk niet gebruikt voor aminozuren. In dit systeem worden prioriteiten
toegewezen aan de substituenten o.b.v. het atoomnummer. De substituent met het laagste
atoomnummer moet steeds naar achter liggen
• (R) enantiomeer = met de klok mee
• (S) enantiomeer = tegen de klok in
Bijna alle aminozuren worden in de (S) enantiomeer gecodeerd
• Glycine is niet chiraal, en heeft dus geen enantiomeren
• Cysteïne heeft een zijketen (CH2SH) met een hogere prioriteit dan de COOH in de backbone en
is dus (R)
,1.4.2. D/L nomenclatuur
De standaard nomenclatuur voor aminozuren en suikers. De nomenclatuur is gebaseerd op
glyceraldehyde:
Voor aminozuren kijkt men naar de amine i.p.v. de alcohol. Alle proteïnogene aminozuren komen
natuurlijk voor in het L-isomeer, behalve glycine (weer o.w.v. achiraliteit).
Voor aminozuren kan de CORN-regel toegepast worden:
• Bekijk het aminozuur met de H naar voor
• Als we COOH, R, NH2, H kunnen lezen tegen de klok in → L-isomeer
1.5. Nummering van C-atomen
De nummering van C-atomen in de zijketen begint met α als de centrale koolstof, en volgt dan met de
rest van het Grieks alfabet (ß, γ, δ,). Indien er meerdere koolstoffen zijn op dezelfde afstand van de α-
koolstof zoals in Val, wordt een numerieke index toegevoegd om deze te onderscheiden.
,1.6. De peptidebinding
Een peptidebinding is een amidebinding die chemisch gezien door een dehydratatiereactie tussen twee
aminozuren wordt gevormd. In de praktijk worden de aminozuren vastgehecht aan tRNA’s en
samengebracht in een ribosoom, en wordt de carboxyl geactiveerd om aangevallen te kunnen worden
door het amine.
1.6.1. Cis/trans configuraties
De peptidebinding heeft een partieel dubbelbindingskarakter t.g.v. resonantie tussen de carbonyl en de
imine.
Dit impliceert een kortere binding, een gebrek aan vrije draaibaarheid en dus discrete cis & trans
configuraties.
,Trans is energetisch veel meer gunstig omwille van de sterische hinder tussen de R-groepen in cis,
behalve als het volgende residu een Proline. Bij Pro is er omwille van het terugvouwen van de zijketen
ook sterische hinder in de trans configuratie → minder verschil tussen de twee isomeren.
Belangrijk is dat er wél vrije rotatie is rond de Cα-C (zgn. Ψ-binding) en N-Cα (zgn. Φ-binding)
bindingen, maar deze toch omwille van een bepaalde context voorkeuren voor bindingshoeken zullen
vertonen (zie Ramachandran plot, meer bij Remy Loris).
1.6.2. PKa’s
De peptidebinding vertoont een permanent dipoolmoment van 3.5 Debye wat maakt dat we een δ+ op
de H en een δ- op O maar omdat de pKa’s respectievelijk 15-18 en -1 bedragen, zijn deze vrij inert zijn
onder fysiologische omstandigheden (O wordt nooit geprotoneerd, H wordt nooit afgegeven). Wel
kunnen de O en H meedoen in waterstofbruggen (later meer)
We zien later dat de dipolen ook een rol spelen in secundaire structuren door elkaar te op te heffen of
elkaar te versterken (→ geeft aanleiding tot een macroscopisch dipoolmoment).
De zijgroepen kunnen wel (de)protonering ondergaan, met de volgende pKa’s (te kennen!)
,1.7. Glycine (Gly, G)
Glycine heeft als “zijketen” een waterstofatoom, en is dus niet reactief. Glycine is ook achiraal, en
bijgevolg ook zeer flexibel. Omwille van deze reden is Gly zeer geconserveerd in turns (bv. helix-turn-
helix).
1.8. De alifatische residu’s
De alifatische residu’s met ongeveer dezelfde eigenschappen zijn
• Alanine (Ala, A)
• Valine (Val, V)
• Leucine (Leu, L)
• Isoleucine (Ile, I)
Deze aminozuren zijn allemaal vrij inert en hydrofoob. Dit maakt hen perfect om de hydrofobe
binnenkant van eiwitten dens & dicht te pakken om de energie van vouwing te minimaliseren, wat een
belangrijke drijvende kracht is voor de spontane vouwing van eiwitten! Omwille van deze reden zijn Ala,
Leu & Ile de meest voorkomende aminozuren. Het bestaan van de verschillende hydrofobe residues
met verschillende vormen maakt dat we ze in de kern écht in elkaar kunnen puzzelen, om holtes en
defecten in de pakking te minimaliseren.
Opmerking: Ile heeft een 2de chiraal centrum op zijn Cß
1.9. Proline, the cyclic amino acid
Proline is ook een alifatisch aminozuur, maar heeft omwille van zijn unieke structuur andere relevante
eigenschappen, nl.
• Geen waterstof in de amide (wanneer betrokken in peptidebinding)
o Geen waterstofbruggen mogelijk
o Niet gunstig in secundaire structuren (α-helices & ß-sheets), ook wel breakers
genoemd
• Restricties op rotatie rond N-Cα (Φ-binding)
o Daarom geconserveerd op plaatsen waar rigide structuren nodig zijn
• Minder grote voorkeur voor trans configuratie dan andere AZ
• Cγ ligt uit het vlak (puckered pyrrolidine ring)
,1.10. De hydroxylresidu’s Serine (Ser, S) & Threonine (Thr, T)
Deze aminozuren hebben een polaire hydroxylgroep, die wél betrokken kan zijn in waterstofbruggen
(zowel als donor via de H als acceptor via de vrije elektronenparen op O) maar een zeer hoge pKa heeft
en dus meestal chemisch vrij inert blijft onder fysiologische omstandigheden.
In sommige eiwit-contexten kunnen deze residu’s wel reactief gemaakt worden. Bijvoorbeeld in de His-
Ser-Asp katalytische triades in serine proteasen (trypsine, thrombine etc.) wordt de gedeprotoneerde,
nucleofiele vorm (O-) gestabiliseerd door His en Asp.
Threonine heeft een tweede chiraal centrum, waarvan ook maar één voorkomt in de natuur.
1.11. De negatief geladen residu’s
Deze zijn Aspartaat (Asp, D) & Glutamaat (Glu, E). De pKa van de carboxylgroep bedraagt ~4. De carboxyl
bevindt zich dus meestal in de geladen COO- vorm bevindt, en is zeer polair.
Hoewel er maar één methyleen groep verschilt tussen de twee, maakt dit toch een redelijk verschil
afstand/interactie met de peptide backbone → COOH van Asp kan bijvoorbeeld interageren met een
backbone-amine. Dit maakt dat Glu makkelijker H-bruggen aangaat.
De formele negatieve lading maakt hen ook geschikt om als chelator op te treden voor metaal-ionen
zoals Ca2+, Mg2+ etc. die als cofactor optreden in veel eiwitten. Fe, Mo, Cu cofactoren worden meestal
gecheleerd door de zwavelhoudende AZ
1.11.1. PKa in eiwitcontext nagaan
We kunnen met X-stralen diffractie moeilijk nagaan of een groep ge(de)protoneerd is omdat
waterstofatomen moeilijk op het diffractiepatroon te zien zijn (weinig elektronen). We weten echter dat
de pKa zal verschillen afhankelijk van de context gevormd door de omringende residu’s.
o Asp215 heeft een pKa van 4.5 (geprotoneerd)
o Asp32 heeft een pKa van 1.1 (gedeprotoneerd)
• Hiv-protease ook ≠ Asp met ≠ pKa
Om na te gaan of Asp/Glu zich in geprotoneerde of gedeprotoneerde vorm bevinden kunnen we ze
laten reageren met diazo amide-compounds of epoxides
, 1.11.2. Amine-carboxyl koppeling
Onder normale omstandigheden zou het moeilijk zijn om een amine te koppelen aan de carboxylgroep
van Asp/Glu o.w.v. de slechte leaving group OH. Echter kunnen we carbodiimide zoals DCC of EDC
gebruiken om de LG te veranderen in een urea derivaat, dewelke veel makkelijker uitgestoten wordt bij
aanval van een amine.
Dit kan gebruikt worden om eiwitten via hun Asp/Glu te koppelen aan een amine (of vice versa om
eiwitten via hun amine – bv. van Lys – te koppelen aan een geactiveerde carboxyl).
Toepassingen hiervan zijn
• DCC voor SPPS (zie Cursus Peptide Chemistry)
• Koppelen van eiwitten aan een CM5 chip voor surface plasmon resonance (later meer)
1.12. De amideresidu’s
De amides van Asparagine (Asn, N) en Glutamine (Gln, Q) zijn polair, maar chemisch vrij inert.
Een paar reacties die toch doorgaan zijn
• Aanval van backbone-amine op de carbonyl van Asn of Asp in basische omstandigheden →
cyclizatie tot een succinimide → vorming van isoAsp
Voordelen van het kopen van samenvattingen bij Stuvia op een rij:
Verzekerd van kwaliteit door reviews
Stuvia-klanten hebben meer dan 700.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet je zeker dat je de beste documenten koopt!
Snel en makkelijk kopen
Je betaalt supersnel en eenmalig met iDeal, creditcard of Stuvia-tegoed voor de samenvatting. Zonder lidmaatschap.
Focus op de essentie
Samenvattingen worden geschreven voor en door anderen. Daarom zijn de samenvattingen altijd betrouwbaar en actueel. Zo kom je snel tot de kern!
Veelgestelde vragen
Wat krijg ik als ik dit document koop?
Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.
Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?
Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.
Van wie koop ik deze samenvatting?
Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper eayassine. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.
Zit ik meteen vast aan een abonnement?
Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €10,49. Je zit daarna nergens aan vast.
