Life Science Samenvatting Course 5
Introductie
De onderwerpen van deze course:
- Eiwitscheidingstechnieken
- Eiwitstructuren
- Signaaltransductie
- Hemoglobine
De PowerPoints zijn leidend. Gebruik de boeken als naslag werk.
Het tentamen is een mix van meerkeuze en openvragen, met vooral openvragen.
Eiwitten
Aminozuren (die hele lijst) komen ook weer in de Course 5 toets.
Functies van eiwitten:
- Je moet de verschillende functies kennen
Eiwitten scheiden:
- Je kunt eiwitten van elkaar scheiden
, - Maar ook eiwitten van onzuiverheden scheiden
Eiwitten worden gescheden omdat het nodig is om eiwitten te scheiden van andere eiwitten
of onzuiverheden om ze te kunnen bestuderen. Als je bijvoorbeeld de functie van een eiwit
wil weten, dan moet je dat eiwit eerst zuiveren zodat je niet last hebt van andere eiwitten.
Wanneer je bijvoorbeeld bacteriën insuline hebt laten maken, dan moet dat insuline
gescheden worden van de andere eiwitten die de bacterie ook produceert voordat het
gebruikt kan worden.
Scheidingstechnieken die je moet kennen:
1. Dialyse
2. 1D SDS-PAGE
3. 2D IEF-SDS-PAGE
4. Chromatography:
• Ion exhange
• Size exclusion
• Affinity Chromatography
5. HPLC
Dialyse:
Dialyse ken je misschien als techniek in het ziekenhuis:
- Wanneer bij een patiënt de nieren niet goed functioneren, dan kan een machine de
nierfunctie overnemen (dus het bloed filteren, en onzuiverheden eruit filteren).
Een dialyse is een eiwitscheidingstechniek, want je haalt onzuiverheden uit mengsels.
,Hoe dialyse werkt (in het algemeen):
- Dialyse is scheiding met gebruik van een semi-permeabel membraan. Een semi-
permeabel membraan is een membraan dat bepaalde stoffen doorlaat, en andere
weer niet. Dat komt doordat het membraan poriën heeft die maar een bepaalde
grootte hebben. Sommige stoffen kunnen daardoor wel door het membraan, andere
weer niet.
- In de afbeelding wordt gebruikgemaakt van een slangetje (dat gele ding), die aan de
boven en onderkant is dicht geklemd. In het slangetje zit een mengsel met grotere
(eiwitten, de rode bolletjes) en kleinere stoffen (onzuiverheden, de blauwe bolletjes).
- Door het slangetje in zuiverwater te leggen, gaan de kleine onzuiverheden uit het
membraan, waardoor er binnen het membraan de groter stoffen (eiwitten) zullen
overblijven (diffusie). De eiwitten worden hierdoor zuiverder, maar je zult nooit
compleet zuivere eiwitten overblijven.
1D SDS-PAGE:
Sodium Dodecyl Poly Acrylamide Gel Electroforese (de 1D staat voor één dimensie).
Het is een analytische techniek, dat wil zeggen dat de techniek wordt gebruikt om eiwitten te
analyseren. Ook beïnvloed deze techniek de eiwitstructuren, waardoor de eiwitten hun
functie verliezen (de eiwitten zijn na de tijd dus niet meer te gebruiken).
Het is een techniek die eiwitten van elkaar kan scheiden. Wanneer je een oplossing hebt met
verschillende eiwitten, dan kun je de eiwitten met deze techniek scheiden, dat gebeurt op
basis van grootte.
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) is een bepaalde stof die gebruikt wordt bij deze techniek.
SDS wordt toegevoegd aan het eiwitmengsel, voordat het door de gel heen wordt getrokken.
SDS doet het volgende:
- Maakt de eiwitten beter oplosbaar
- Geeft de eiwitten (dezelfde) negatieve lading
- Denatureerd en geeft de eiwitten dezelfde vorm
Hierdoor wordt er alleen gescheden op grootte, en is bijvoorbeeld vorm of lading niet van
invloed op de scheiding.
, - Voor deze techniek gebruik je een gel. Boven in de gel heb je poriën waarop je je
eiwitmengsel kunt laden. Vervolgens wordt er een elektrische stroom door de gel
gevoerd, van - naar +.
- De eiwitten in het mengsel worden dan door de gel heen getrokken. De gel zelf is
poreus en zit vol met kanaaltjes. De kleinere eiwitten worden makkelijker door de gel
heen getrokken, en de grotere eiwitten lastiger. De grotere eiwitten zullen zich dus
boven in de gel bevinden, de kleinere onder in de gel.
- Het resultaat kun je daarvan bekijken. Elk bandje is daarin een eiwit.
Eiwitten hebben een bepaalde grootte, die word aangegeven in het gewicht van dat eiwit
(molecular weight). De eenheid is Dalton (of kilo Dalton).
,Er kan dus een groot verschil zitten in de gewichten van eiwitten, en dat kan worden gebruikt
om onbekende eiwitten te identificeren.
Om nou een conclusie te trekken uit je resultaten, kun je een ladder toevoegen. Een ladder
is een eiwitmengsel waarvan je weet welke eiwitten er inzitten, en hoe groot die eiwitten zijn.
- Door een ladder te gebruiken met eiwitten van verschillende, bekende, groottes kun
je de grootte van de onbekende eiwitten uit het mengsel afleiden met behulp van de
ladder.
2D IEF-SDS-PAGE:
Isoelectric Focussing Sodium Dodecyl Poly Acrylamide Gel Electroforese (2D staat voor 2
dimensies).
Deze scheidingstechniek scheid eiwitten op basis van twee factoren. De 1D scheidde de
eiwitten alleen op basis van grootten, maar de 2D doet op basis van grootte EN
isoelectrische punten (pI).
Het stuk SDS-PAGE gaat over het scheiden op basis van grootte, IEF gaat over het
scheiden op basis van isoelectrische punten.
Het isoelectrisch punt van een molecuul is de pH waarbij het molecuul (eiwit in dit geval) een
netto lading heeft van 0. Dus de pH waarbij het molecuul even veel positieve als negatieve
lading heeft (maar alsnog kan er plaatselijk wel lading zijn in het molecuul).
Deze scheidingsmethode gebeurt ook met een gel. Op die gel is een pH gradiënt. Wanneer
er een stroom door de gel gaat lopen, gaan de eiwitten migreren tot de pH van hun pi, dus
waar ze een netto lading van 0 hebben.
, - Je hebt een kolom met daarin de gel, waarin een pH gradiënt is aangebracht van pH
9 tot pH 3. pH 9 is de negatieve kant, want hoe hoger de pH, hoe minder H+, hoe
negatiever. pH3 is de positieve kant, want hoe lager de pH, hoe meer H+, hoe
positiever.
- Vervolgens wordt een eiwitmengsel geladen, en gaat er een stroom door de kolom
lopen (ook weer van - naar +).
- Elk bandje in de kolom is een groep eiwitten met dezelfde pi. Bovenaan bevinden
zich de eiwitten met een hoge pi, onder met een lage pi.
Verschillende eiwitten kunnen uiteenlopende pi’s hebben:
- Bijvoorbeeld Urease: Urease heeft een pi van 5.0. Dit houd in dat wanneer Urease in
een omgeving is van een pH van 5, dan is Urease zelf ongeladen; een lading van 0.
,Ieder aminozuur heeft zijn eigen pi.
- De pi is een afgeleide van de pKa. De pKa is de -log van de zuurconstante.
- Binnen een aminozuur heb je verschillende gedeeltes (carboxyl groep, ammonium
groep en een zijgroep) en ieder gedeelte heeft zijn eigen pKa. De pI is opgebouwd uit
de verschillende pkA’s.
- De meeste pI’s zitten rond de 5/6, op de 5 onderste na. Dat is het groepje dat
geladen is (de DERK aminozuren). Histidine staat er ook bij omdat histidine een
lading krijgt bij een niet pH neutrale omgeving.
Dus wanneer de pH gelijk is aan de pI, dan heeft het eiwit een netto lading van 0, maar wat
nou als die 2 niet gelijk zijn aan elkaar:
- Wanneer de pH kleiner is dan de pI, dan heeft het eiwit een positieve lading. Een
lagere pH betekent meer H+ en die H+ die protoniseren het eiwit (binden aan het
eiwit), waardoor het geheel een positieve lading krijgt.
- Wanneer de pH groter is dan de pI, dan heeft het eiwit een negatieve lading. Een
hogere pH betekent minder H+ waardoor er minder H+ binden aan het eiwit, waardoor
het een negatieve lading krijgt.
,Als voorbeeld: histidine heeft een pI van 7,59. Als de pH dan ook 7,59 is, dan is heeft
histidine een lading van 0. Is de pH lager dan 7,59 dan is histidine positief, is de pH hoger
dan 7,59 dan is histidine negatief.
Dat is de scheiding op basis van pI. Nu komt de scheiding op basis van grootte.
De scheiding op grootte gebeurt op vergelijkbare manier als bij de 1D SDS-PAGE:
- De kolom die is gebruikt voor de pI scheiding, die wordt op een gel gezet.
, - Vervolgens gaat er een stroom door de gel, en vind er een scheiding plaats op basis
van grootte.
- Vervolgens heb je resultaten waarin je de massa en pI van een eiwit kan afleiden.
In het echt ziet dat er wat onduidelijker uit:
Deze scheidingsmethode kun je goed gebruiken wanneer je bijvoorbeeld een eiwitmengsel
hebt van een weefsel dan kun je dit met 2D IEF-SDS-PAGE vergelijken met andere
eiwitmengsels van andere weefsels. Door te kijken na patronen kun je vervolgens verschillen
over overeenkomsten aanduiden.
Wanneer zou je nou welke gebruiken:
- 1D SDS-PAGE is een analytische techniek. Je wilt bijvoorbeeld die insuline uit de
bacteriekolonie krijgen, en je wilt controleren of het ook daadwerkelijk insuline is.
Wanneer je dan een kleine hoeveelheid van het epje op de gel zet, en er komt een
bandje op de hoogte van het gewicht van insuline, dan weet je dat er insuline in zit.
- 2D IEF-SDS-PAGE gebruik je voor het vergelijken van vooral weefsels ofzo. Het is
allemaal niet heel exact en het is moeilijk af te lezen.
Opdrachten 1, 2, 3 en 4. 4 is erg belangrijk en komt in de toets!
, Chromatografie
3 vormen van chromatografie de we gaan bekijken:
- Ion Exchange
- Size Exclusion
- Affinity Chromatography
Chromatografie kent altijd een aantal vaste componenten:
- De kolom bevat een poreuze matrix (een soort van gel) waardoor het mengsel
(Protein Sample in afbeelding) dat bovenin zit heen kan. De vloeistof in het resevoir
helpt het eiwit mengsel om door deze gel heen te gaan. Aan de onder kant zit een
“kraantje” waardoor je de vloeistof er ook weer uit kan krijgen.
- De eiwitmengsels trekken door de kolom heen, en worden in die kolom gescheiden.
Afhankelijk van het type chromatografie wordt bepaald op welke eigenschap ze
worden gescheden.
- Het verschil met chromatografie en bij SDS-PAGE is dat bij chromatografie de
eiwitten wel intact blijven. Bij deze techniek kun je dus nog verder werken met de
eiwitten na het scheiden.
Er zijn verschillende typen chromatografie, en elke heeft zijn eigen manier van scheiden:
- Ion Exchange
- Size Exclusion
- Affinity Chromatography
