Samenvatting van de hoorcolleges/boek genetica en evolutie aan de Universiteit van Amsterdam (opleiding: biomedische wetenschappen). Alle colleges voor de tweede deeltoets van 2016 staan erin! Ik had uiteindelijk een 8!
Mensen hebben meer dan 3 miljard base paren, in een gen zitten een paar duizend basenparen.
Vandaar dat het isoleren van deze base paren interessant is.
DNA technology: Is een term voor verschillende technieken gebruikt om DNA te krijgen,
vermeerderen en manipuleren.
Genetic engineering: Het koppelen van DNA technologie aan biologische, medische of agriculturele
problemen.
Genomics: Is de technologie voor globale analyse van aminozuren die in de kern, cel, organisme of in
een soort voorkomt.
Als je een stuk DNA wilt bekijken moet je wel genoeg DNA hebben, daarom vermeerderen we dit
stuk dmv amplification. Dit kan zowel in een bacterie (in vivo) of in een reageerbuis (in vitro).
• In vivo: Je begint met een sample van DNA moleculen waarin het gen zit wat je wilt
onderzoeken. Dit sample wordt het donor DNA en is meestal een heel genoom. Dit genoom
wordt geïnjecteerd in een plasmid of virus dat het gen vermeerderd, dit noemen we vectors.
Het donor DNA wordt in kleine stukjes geknipt door restriction enzymes. Ieder fragment
wordt geinsert in het vector chromosoom en deze vormen recombinant DNA moleculen.
Deze moleculen worden getransferd in het bacteriële DNA. Tijdens celdeling wordt ook deze
vector vermeerderd, dit noemen we DNA cloning.
• In vitro: Dit wordt de polymerase chain reaction (PCR)
genoemd. Een specifiek stukje gen/DNA wordt geïsoleerd
en daarna vermeerderd door DNA polymerase. PCR vindt
het stukje DNA wat interessant is en primers binden aan
een specifiek stukje DNA. Hierdoor vind er replicatie van
DNA plaats. Dit wordt voor verschillende rondes herhaald,
hierdoor krijgen we heel veel DNA. Nog grotere
hoeveelheden kunnen worden verkregen door het PCR
product in een plasmid te doen, hierdoor krijgen we
recombinant DNA.
Recombinant DNA is in de meeste gevallen een DNA fragment
ingebouwd in een bacteriële vector. Er zijn verschillende bronnen van donor DNA:
• Het hele genoom, hierbij wordt het hele DNA in kleine stukjes opgeknipt.
• Een gen, hierbij wordt mbv PCR specifieke stukjes van dit DNA vermeerderd.
• Exons van een gen, hierbij worden DNA kopieën van het
mRNA gemaakt (cDNA) en in een vector gestopt.
Als een stuk genomic DNA moet worden geknipt gebeurd dit met
restriction enzymes. Deze enzymen knippen op restriction sites. Deze
enzymen bevatten een phosphodiester bond tussen nucleotiden en
DNA. De stukjes DNA die overblijven na het knippen noemen we
restriction fragments. Veel van deze restriction enzymes creëren “sticky
ends”. (De strengen DNA worden niet op hetzelfde punt geknipt, als dit
wel zo is heten ze “blunt ends”.) DNA sequenties die hetzelfde zijn als je
ze omdraait heten DNA palindrome. Een stuk DNA binden aan de sticky
end heet hybridization.
,Bij PCR moeten eerst de 2 strengen uit elkaar gehaald worden
waarna de 2 primers aan verschillende DNA strengen binden. DNA
polymerase voegt basen toe van 3’ naar 5’ waardoor de target
sequence gekopieerd wordt. Als dit proces vaak herhaald wordt
krijg je genoeg DNA om het gen te bestuderen. Voor details zie
pagina 356-357.
Minder dan 5% van het genomische DNA is eiwit coderend. Als we
alleen geïnteresseerd zijn in dit stuk DNA kunnen we mRNA
gebruiken als start materiaal van de PCR. Complementary DNA
(cDNA) is de DNA versie van dit mRNA. We gebruiken dit DNA ipv
RNA omdat dit makkelijker over erft. DNA kan ook makkelijker
gemanipuleerd worden. Dit
cDNA wordt gemaakt mbv een
enzym wat reverse
transcriptase heet. Als dit
omgezet is in cDNA kopieert
DNA polymerase cDNA en
wordt het dubbelstrengs DNA.
Dit kan dan verder
vermeerderd worden voor
verder onderzoek.
De volgende stap is
recombinant DNA maken door
donor DNA in vector DNA te
inserten. Er zijn 2 manieren
hiervoor:
1. MBV sticky ends: Om recombinant DNA te maken moeten zowel donor als vector DNA
geknipt worden door restriction enzymes die dezelfde complemente sticky ends produceren.
Deze fragmenten worden dan gemixt waardoor de sticky ends kunnen hybridiseren om
recombinante DNA moleculen te vormen. DNA ligase plakt stukjes DNA aan elkaar door
phosphodiester linkages te maken.
2. MBV blunt ends: Deze stukjes kunnen aan elkaar worden gemaakt door DNA ligase alleen.
Dit proces is alleen erg inefficiënt omdat deze einden niet aan elkaar
plakken. Het is wel mogelijk om mbv cDNA synthese of PCR zoals te
zien is op het 2e en 3e plaatje hieronder.
,De vermeerdering van donor DNA in een bacteriële cel heeft een paar
stappen:
1. Choice of cloning vectors: Het moeten kleine moleculen zijn
en restriction sites hebben waarmee het in het DNA kan
worden gestopt. Ideaal zou zijn als deze restriction sites maar
1 keer voorkomt in de vector want dan weet je zeker dat het
op die locatie zit.
a. Plasmid vectors: Kleine circulaire DNA moleculen die
hun DNA onafhankelijk van het bacteriële
chromosoom repliceren. Deze vectors worden vaak
gebruikt voor drug resistance genen. Er is een plasmid
waarbij je goed kan herkennen of het DNA is
ingebouwd. Zie plaatje hiernaast.
b. Bacteriophage vectors: Dit is DNA wat als een pakje in
een phage zit. Het genomische DNA wordt hierbij vervangen door het donor DNA.
c. Vectors for larger DNA inserts: Plasmids en phage vectors kunnen DNA accepteren
van 10-15 kb. Soms moeten er grotere stukken DNA gedoneerd worden. Hiervoor
zijn weer andere vectors namelijk Fosmids die 35-45 kb kunnen dragen en BAC die
komt van de F plasmid en 100-200 kb kan dragen.
2. Entry of recombinant molecules into the bacterial cell: Er zijn 3 verschillende methoden om
recombinant DNA in bacteriële cellen te stoppen.
a. Transformation: Is het opnemen van een
stukje DNA van buiten de cel (Dit komt dus
niet direct uit een andere bacterie).
b. Transduction: Phages pakken stukjes DNA
op van een bacterie en brengen dit naar een
andere bacterie.
c. Infection: In tegenstelling tot transduction
worden hier nieuwe phages gevormd.
3. Recovery of amplified recombinant models: Het recombinante DNA wat in
phages zit is makkelijk te verkrijgen door het phage lysate te verzamelen en
het DNA te isoleren. Bij recombinant DNA in plasmids, fosmids of BACs
moeten de bacteriën kapot gemaakt worden. Het DNA wordt geïsoleerd
dmv centrifugatie, elektroforese en andere technieken.
Genomic library: Collectie van recombinant DNA uit bacteriën en bacteriophages.
cDNA library: Collectie van cDNA klonen dmv het hele bovenstaande proces.
Als zo’n library is gemaakt moet de kloon met het recombinante DNA wel gevonden
worden. Dit wordt gedaan met een probe die alleen dit specifieke DNA vindt en
bindt. Er zijn 2 soorten; de ene herkent nucleic acid sequence en de ander herkent
een eiwit.
1. Probes for finding DNA: Maakt gebruik van base complementary. 2 Enkele
strengen DNA kunnen elkaar vinden en vullen elkaar aan. Als eerste worden
de kolonies van de bibliotheek op een membraan gedaan. Als tweede wordt
het membraan overspoeld met een oplossing met daarin enkel DNA
complement aan de DNA sequence die gezocht wordt. Deze probe is
, meestal fluorescent gelabeld. Voor radioactieve probes wordt een foto gemaakt via een
autoradiogram. Het DNA om een probe te maken komt meestal van een homoloog gen van
een gerelateerd organisme of het eiwit product van het gen. Dit wordt dan terug
getransleerd.
2. Probes for finding proteins: Dit proces heeft 2
componenten nodig. Als eerste moet er een
bibliotheek zijn die het eiwit maakt. Dit wordt
gemaakt door cDNA in een vector te inserten
zodat dit uiteindelijk kan worden omgezet naar
eiwit. Als tweede is er een antibody (een eiwit
dat sterk een een molecuul bindt, imuunsysteem)
nodig die aan het eiwit van het specifieke gen
bindt. Ook hier wordt een membraan gebruikt.
Hierna wordt een vloeistof met antibody
eroverheen gedaan waardoor de antibody bindt
aan het juiste eiwit. Ook deze kan je later zien
met een autoradiogram.
In veel gevallen is de probe voor het gen wat we zoeken er niet. We hebben wel een recessieve
mutatie in dit gen. In praktijk wordt er een library gemaakt van een organisme met het wild type. 1
Gen in deze library heeft de mogelijkheid om het gen van het mutante organisme te
complementeren. We kunnen dit gen dan herkennen. Dit noemen we functional complementation
of mutant rescue.
Als je PCR product vermeerderd is kan je meer onderzoek
doen naar dit DNA mbv gel electrophoresis. Hierbij
worden moleculen gesorteerd. Er is een gel in een doos
met 2 elektroden. Het DNA gaat lopen in de richting van de
positieve anode. De kleine moleculen lopen het snelst door
de gel en zullen dus het laagst eindigen. De bandjes in de
gel worden zichtbaar gemaakt dmv UV licht.
Southern blotting: Een techniek waarbij een probe 1
fragment (uit 1 bandje, hier zitten meestal nog meerdere
fragmenten in) kan identificeren. Deze techniek werkt
met een imprint van DNA moleculen op een
membraan waarna de probe bindt aan het juiste
enkelstrengse DNA.
Northern blotting (RNA blotting): Dit werkt hetzelfde als Southern blotting
alleen dan met RNA.
Probing for a specific protein: Meestal gedaan met behulp van antibodys. Ook
dit kan worden gedaan na een PCR.
Nadat we het gen hebben gevonden door PCR willen we de base sequence
weten. Er zijn meerdere technieken hiervoor. We bekijken hier dideoxy
sequencing, ook wel Sanger sequencing genoemd. “Dideoxy” komt van een
speciaal nucleotide namelijk ddNTP. Deze nucleotide kan continued DNA
synthesis blokkeren. Het heeft geen 3’ en 2’ hydroxyl groep. Omdat de 3’ niet
aanwezig is en DNA polymerase deze wel nodig heeft wordt de synthese gestopt.
Voordelen van het kopen van samenvattingen bij Stuvia op een rij:
Verzekerd van kwaliteit door reviews
Stuvia-klanten hebben meer dan 700.000 samenvattingen beoordeeld. Zo weet je zeker dat je de beste documenten koopt!
Snel en makkelijk kopen
Je betaalt supersnel en eenmalig met iDeal, creditcard of Stuvia-tegoed voor de samenvatting. Zonder lidmaatschap.
Focus op de essentie
Samenvattingen worden geschreven voor en door anderen. Daarom zijn de samenvattingen altijd betrouwbaar en actueel. Zo kom je snel tot de kern!
Veelgestelde vragen
Wat krijg ik als ik dit document koop?
Je krijgt een PDF, die direct beschikbaar is na je aankoop. Het gekochte document is altijd, overal en oneindig toegankelijk via je profiel.
Tevredenheidsgarantie: hoe werkt dat?
Onze tevredenheidsgarantie zorgt ervoor dat je altijd een studiedocument vindt dat goed bij je past. Je vult een formulier in en onze klantenservice regelt de rest.
Van wie koop ik deze samenvatting?
Stuvia is een marktplaats, je koop dit document dus niet van ons, maar van verkoper nadinevankleef. Stuvia faciliteert de betaling aan de verkoper.
Zit ik meteen vast aan een abonnement?
Nee, je koopt alleen deze samenvatting voor €6,49. Je zit daarna nergens aan vast.
