Hoorcollege 1.1 (Gary): Overview Proteomics
DNA is overal in je lichaam hetzelfde, RNA is niet overal hetzelfde. Eiwit expressie is niet gerelateerd
aan RNA of DNA. Sommige eiwiten wel, maar de meeste niet. Het belangrijkste is waar en wanneer
de eiwiten tot expressie worden gebracht. We hebben kwantitatieve proteoicsve nodig, je wilt
veranderingen meten. Meten van verschil in plaate en tijd. Poet-tranelational icodsfvatione zijn ook
belangrijk bij proteomics. We weten niet hoe en waar iets gemodifceerd wordt, we kunnen het niet
afleiden uit DNA. dellen zijn geen soep, het zit vol met eiwiten. Voric se gerelateerd aan funvtie.
Eiwiten werken bijna nooit alleen, er zijn pathways.
Belangrijk bij proteomics:
Meten van plaats en tjd.
Post-translatonal modifcatons.
Pathways & complexen/structuren.
dontext afankelijk.
Tentamen: Voorbeelden geven van het bovenstaande
Het huican genoice projevt zorgde ervoor dat alle biomoleculen gecodeerd door het genoom
gedefnieerd waren, het zorgde voor ontwikkeling van technologienn voor grote-schaal metngen
(high throughput). Hieruit ontstonden nieuwe concepten.
Proteooic: Alle eiwiten die tot expressie zijn gebracht door het genoom in een cel, weefseltype of
waar dan ook. Er is maar 1 instrument om eiwiten te meten, massaspectrometrie.
We gaan met proteomics van 20.000 genen naar miljoenen eiwiten. We nemen een cel (20.000
genen), we kunnen geen eiwiten in een MS doen, daarom moeten we bottoic-up proteoicsve doen.
Dit betekend dat je het eiwit op bepaalde plekken knipt en de delen meet om vervolgens het gehele
eiwit te reconstrueren. We zijn wel methoden aan het ontwikkelen om het hele eiwit te meten. We
zijn afankelijk van este epevsfv vleavage van een eiwit-mix. We krijgen door enzyicativ dsgeetion
een heel complexe mix van peptdes om te meten.
42 x 20.000 genen door het knippen(42 peptdes per eiwit), daarbovenop nog de post
translatonal modifcatons. Met 10 post-translatonal modifcatons hebben we al 8,5 miljoen
mogelijke peptdes. We maken dus een probleem!
Unieke karakteristeken van proteomes:
Het proteoom is dynaicsek (kwanttateve proteomics)
Eiwiten hebben icodsfvatione (PTM analyse)
Eiwiten werken in vluetere (protein-protein interactes)
Kwantitatieve proteoicsve:
Standard MS workfow: del lijn wordt gebruikt als model voor een ziekte. We groeien cellen
op een Petri schaaltje, purifceren de eiwiten, we genereren peptdes, dan gooien we het in
de MS en analyseren we de massa’s van de eiwiten.
Tsice baeed avqusestion: Massa tegenover tjd.
Intenesty baeed avqusestion: Intensiteit tegenover tjd.
Een aantal methoden om de organseatie van het proteaeoice te bekijken:
, Affinsty pursfvatie: Geef aan welke eiwiten bij elkaar horen. We hebben een antlichaam
tegen het eiwit wat we willen hebben waardoor we deze eruit kunnen halen. We
identfceren ook eiwiten die aan dat eiwit zijn gebonden. We vernietgen interactes niet.
Cheicsval vroeelsnksng: Geef topologie van een eiwitcomplex aan. We crosslinken delen van
eiwiten. De crosslinked peptdes hiervan geven informate over welke delen van welke
eiwiten dicht bij elkaar ziten in een eiwitcomplex.
Correlation proflsng: Geef aan welke eiwiten bij elkaar horen. Een cel
lysate wordt gefractoneerd door groote-exclusie chromatografe met
daarna MS. We vernietgen interactes niet.
Proxsicsty labelsng(BsoID): Het capturen van stabiele eiwitcomplexen
en tjdelijke interactes tussen eiwiten. Ubsqustine bsotin lsgaee fuseert
aan een eiwit waar we geïnteresseerd in zijn om alle eiwiten in de
omgeving te bsotinyleren. De gebiotnyleerde eiwiten kunnen dat via
afnity purifcate en MS worden geïdentfceerd.
Applicates:
Applicates van kwanttateve proteomics in pereonalszed icedsvsne zijn normaal gebaseerd
op bsoicarkere die het risico op ziekte of staat van ziekte aangeef.
We hebben ook population evreensng en longstudsnal iconstorsng. Hiervoor heb je een grote
hoeveelheid patnnten nodig. Met populate screening en longitudinal monitoring kan je
dingen voorspellen(lengte kinderen). Met populate screening kunnen we bv. drug treatment
meten
Kunnen we proteomes compleet en accuraat meten? Het moeilijkste is om alle mogelijke seoforice te
meten, we kunnen dat niet. Het is veel te dynaicsek en veranderd door tijd en lovatie, daarnaast heb
je PTM’e en icolevulasre partnere.
,Belangrijk: De structuren zijn eiwiten zijn erg belangrijk om de functe en plaats te bepalen. De
organisate van het proteasome in de cel zijn heel belangrijk, er zijn 4 verschillende methoden om die
te bepalen. Eiwiten doen nooit iets alleen, pathways of complexen. Moleculaire medicijn: we
bekijken welke moleculen zeggen dat iemand ziek is of een risico voor ziekte heef. Waarom
bestuderen we eiwiten? PTMs, plaats & tjd en pathways/structuren. Hoe bestuderen we eiwiten?
Massa spectometrie, 2 types: MALDI(gehele weefsels, met een laser) & ESI(weefsel of cel extracten,
combineren met chromatografe).
Geen idee waar dit vandaan komt:
Typical comprehensive molecular analyses:
Quantty and compositon defnes cell state diagnostsch, klassifcate.
Subtractve analysis can target cell mechanism functonele studies.
We sequencen geen hele proteasomen, we kunnen het niet.
Eerder onderzoek maakt het mogelijk om structuur te voorspellen aan de hand van de sequente
(primair, secundair etc.). We weten ook dat eiwiten in pathways werken. Via de structuur kunnen
we hier ook wat over zeggen(heel moeilijk). We weten dat eiwiten ziekte veroorzaken en dat bijna
alle drug targets eiwiten zijn.
Vroeger isoleerde we alles helemaal om het daarna terug te redeneren naar het systeem
(reductonistsch), nu kijken we naar hele systemen (holistsch, systeembiologie).
Actvty centered biology: relate tussen sequente en functe.
Hypothesis based research: Omics! Je genereert ideenn, je kijkt naar veranderingen. Er zijn
kwanttateve metngen. Kijk of je context kan krijgen uit bijvoorbeeld PTMs.
Vanuit systemen (elementen: moleculen, cellen, organen, individuen of ecosystemen) kunnen
netwerken van interactes ontstaan. We kunnen netwerken van normale en zieke patnnten
vergelijken.
Hoorcollege 1.2 (Gary): Kwantitatieve proteomics
We kunnen niet alles meten, het is te complex. We kunnen 3000-6000 eiwiten meten, dat is weinig.
Het is mogelijk om 6000-15 000 te meten, dit duurt heel lang dus is niet praktsch. We kunnen alleen
sdentifveren maar geen verandersng meten. We moeten labele gebruiken om eiwiten te meten. We
kunnen relatief en abeoluut kwantfcate meten. Relatef is ik vergelijken tussen samples. Absoluut is
het precieze aantal meten. Vaak is data wel absoluut maar relatef geïnterpreteerd, hiermee kunnen
ze een statement maken over wat de absolute waarde betekend. Label-free is alleen relatef, dus
vergelijkingen. Met label kan je zowel relatef als absoluut meten.
Abeoluut: Mol gemeten, absolute concentrate van eiwiten/peptdes in een vloeistof/cel/weefsel.
Relatief: Units gemeten, concentrate van eiwiten/peptdes in vergelijking tot een standaard en/of
vergelijkbaar vloeistof/cel/weefsel in een andere fysiologische staat.
Kwantifvatie is gebaseerd op seotoop ratio’e, het vergelijken (van de metng) van peptdes met
verschillende massa’s. De peptde intensiteit kan worden gemeten als het signaal overeenkomt met
peptdes met een identeke structuur (dus isotopen). Een seotoop is hetzelfde element maar met een
verschillende massa door een ander aantal neutronen.
Je kunt kwantfcate gebaseerd op isotoop rato’s op verschillende manieren aanpakken:
, Stable seotope labelsng (relatef).
Ieotope dslution (absoluut): Een bekende hoeveelheid van een molecuul wordt toegevoegd
die een bepaalde bekende massa heef.
Label free approavhee: Ion current of spectral countng.
Labeling:
Bsologsval snvorporation: Terwijl de cellen groeien worden de labels incorporated. Geen
purifcate stappen en geen labeling protocol. Errors in sample processing hebben geen efect
op kwantfcate. Nadeel: We weten het biologische efect van de isotopen niet (dus niet
legaal in levende wezens).
Cheicsval snvorporation: dhemische modifcates aan aminozuren. We groeien cellen onder 2
condites, harvesten het, en daarna gooien we labels erbij. Daarna purifceren we de eiwiten
en gooien we het in een MS. Het is handig voor allerlei soorten samples (cellen, vloeistof
etc). Je kunt ook een afnity groep toevoegen(biotn tag). De peptdes met afnity tags/solid
support blijven achter. Het wordt geknipt en het deel met de label gaat door MS heen.
Enzyicativ snvorporation: Bijna niet gebruikt.
Label free MS iceaeureicente: Ontwikkeld voor eiwit kwantfcate, vooral voor het meten
van grote cohorten eiwiten. Er zijn 2 manieren, precursor ion/MS1 en fragment ion/MS2.
o MS1: Alignment van sample 1 tegen sample 2. Intensiteit van ionen worden gemeten
in retente tjd.
o MS2 of MS/MS: Je telt leterlijk het spectrum door je ionen te fragmenteren en dan
opnieuw te meten. Meten op MS level is makkelijker dan MS/MS level.
Hoorcollege 1.3 (Gary): Eiwit identifcatie
Maee epevtroiceter: We ioniseren, sorteren en detecteren. Het gebeurd allemaal in een vacuüm. Je
krijgt een icaeea epevtruic. De neutrale moleculen(in gas fase, druppel verdampt) worden
geïonseeerd tot ionen (opgeladen, anders kan het niet worden gemeten), ze worden vereneld door
een elektrisch veld en worden daarna geevhesden op massa (ic/z). Dit staat voor icaeea vharge ratio,
dit zorgt voor de richtng van het molecuul in de meter. We moeten “soft ionisate gebruiken zodat
het molecuul niet wordt gefragmenteerd (bij hite gebeurd dat wel).
MALDI: Solid-phase techniek, microarrays en chips. Voor het analyseren van
weefsels of individuele cellen van micro-organismen. Je krijgt enkel geladen
ionen, zowel negatef als positef. Er is een laeer(UV of IR) die in een krsetal
schiet, hierdoor komen er peptide/eswst sonen vrij doordat het van liquid
naar gas gaat, de matrix zet uit. Het hebben van goede krsetallseatie is
essenteel. We meten de tijd totdat het de detevtor raakt. Een klein ionen
