Hoofdstuk 6 DNA replicatie, repair en recombinatie
DNA replicatie
Template streng, omdat de twee DNA strengen complementair zijn aan elkaar, kan elke streng als
template streng dienen voor replicatie.
Replicatie machine, voordat een cel kan delen, moet het DNA gerepliceerd worden en het gaat
dan om miljarden nucleotidenparen. Toch vindt deze replicatie al maar liefst binnen 8 uur plaats
met grote precisie. Dit wordt allemaal uitgevoerd door een cluster van eiwitten: replicatie
machine.
Semiconservatief, de wijze van DNA replicatie is semi-conservatief wat wil zeggen dat je bij
replicatie niet één compleet nieuwe dubbele helix krijgt en een oude, maar dat de dochtercellen
een dubbele helix krijgen die zowel een nieuwe als oude streng bevat. Dit is rechts in de
afbeelding weergegeven.
Initiatie eiwitten, de DNA helix is erg stabiel en de strengen zullen dan ook pas uit elkaar gaan bij
een temperatuur van kokend water. In de cellen kan je deze temperatuur echter niet bereiken, maar
de strengen zullen toch uit elkaar gehaald moeten worden voor replicatie. Daarbij komen de initiatie
eiwitten kijken die aan een specifieke DNA sequentie binden (de ORI) en daar de H-bruggen
verbreken. Ondanks dat de vele H-bruggen samen een sterke binding opleveren, zijn enkele H-
bruggen makkelijk te verbreken. Als de initiatie eiwitten eenmaal H-bruggen verbroken hebben,
trekken zij een groep eiwitten aan die de DNA replicatie verricht. Deze eiwitten vormen een
replicatie machine waarbij elk eiwit een specifieke functie heeft.
ORI, een origin of replication bevat vaak veel A-T baseparen, omdat zij maar door 2 H-bruggen bij
elkaar gehouden worden, terwijl C-G door 3 H-bruggen bij elkaar gehouden wordt. Verder heeft een
bacterie maar 1 ORI voor zijn circulaire DNA, terwijl de mens er ongeveer 10.000 heeft. Dat zijn
gemiddeld 220 ORI’s per chromosoom. Dit verkort de tijd die nodig is voor replicatie.
Replicatie vork, bij elke ORI worden 2 replicatievorken gevormd en bij elke vork
beweegt een replicatie machine over het DNA die de H-bruggen verbreekt en nieuw
DNA synthetiseert. In bacteriën beweegt de vork zo’n 1000 nucleotiden per seconde en
in mensen, maar zo’n 100 nucleotiden per seconde. Dit verschil kan komen doordat
eukaryoten een complexere chromatine structuur hebben.
Bidirectioneel, DNA replicatie in bacteriën en eukaryoten is bidirectioneel, omdat de replicatie
vorken allebei een andere richting opgaan.
DNA polymerase, is het hart van de
replicatiemachine en dit enzym
katalyseert het toevoegen van
nucleotiden aan het 3’ uiteinde van een
groeiende DNA streng. Hierbij wordt
dus een fosfodiëster binding gevormd
tussen het 3’ uiteinde van de groeiende
streng het 5’ uiteinde van een losse
nucleotide die de reactie aangaat als
een deoxyribonucleoside trifosfaat. De
energie voor de polymerisatie is dan
afkomstig van hydrolyse van de
fosfaatgroepen waarbij dus een
pyrofosfaat afgescheiden wordt van de
nucleotide.
Asymmetrie replicavork, DNA is antiparallel wat wil zeggen dat een van de twee
strengen in de 5’ naar 3’ richting loopt, terwijl de andere in de 3’ naar 5’ richting
loopt. Hierdoor is de replicatievork dus asymmetrisch, zoals rechts is weergegeven.
DNA polymerase kan echter alleen in de 5’ naar 3’ richting polymeriseren dus ondanks
dat het in de afbeelding misschien lijkt of de strengen in dezelfde richting groeien, is dat niet het
geval. De DNA streng die naar in de richting van de replicatievork (rechts) van 3’ naar 5’ loopt kan op
, een continue manier gerepliceerd worden, omdat DNA
polymerase dan met de richting van de vork een 5’-3’ streng
maakt. De tegenovergestelde streng kan echter niet in een
keer gesynthetiseerd worden en wordt discontinue
aangemaakt wat wil zeggen dat er steeds korte stukje DNA
aangemaakt worden, zoals in de afbeelding rechts is
weergegeven.
Okazaki fragment, de streng die discontinue aangemaakt
wordt, bestaat uit korte fragmenten die we Okazaki
fragmenten noemen. Deze fragmenten worden uiteindelijk
aan elkaar gezet.
Lagging strand, de streng die discontinue aangemaakt
wordt, noemen we de lagging strand/volgende streng.
Leading strand, de streng die in een keer aangemaakt
wordt, noemen we de leading strand/leidende streng.
Fouten, DNA polymerase maakt maar bij 1 op de 107 nucleotidenparen een fout bij replicatie. Het
maakt zo weinig fouten doordat:
- Het enzym goed kijkt naar de baseparing tussen een aankomende nucleotide en de template
streng. Alleen als de match goed is, zal DNA pol de reactie katalyseren.
- Als DNA pol de fout maakt om een verkeerde nucleotide in te bouwen, kan het zichzelf
corrigeren d.m.v. proofreading.
Proofreading, vindt tegelijkertijd met DNA synthese plaats. Voordat het
enzym een volgende nucleotide inbouwt, controleert het eerst of de
vorige nucleotide correct gebasepaard is met de template streng. Als dat
het geval is, wordt de volgende nucleotide geplaats. Als de vorige
nucleotide echter niet goed geplaatst is, zal DNA pol dat nucleotide
afknippen en opnieuw een juist nucleotide proberen te plaatsen. Deze
klieving wordt door nuclease uitgevoerd en dat bevindt zich op een
andere locatie in DNA polymerase dan het gebied dat aan polymerisatie doet. Polymerisatie en
proofreading zijn dus goed gecoördineerd en worden door twee verschillende katalyserende
domeinen van hetzelfde polymerase molecuul uitgevoerd.
Primase, DNA pol heeft een 3’ uiteinde nodig om een nieuwe nucleotide in te bouwen en kan dus
niet meteen met replicatie beginnen zodra er een ORI is geopend. Hierbij komt primase kijken. Dit
enzym kan een complementaire streng beginnen zonder daar een bestaand uiteinde voor nodig te
hebben. Primase maakt een RNA primer die complementair is aan de template DNA streng van
ongeveer 10 nucleotiden lang, waardoor DNA polymerase een 3’ uiteinde heeft om mee
te beginnen. Primase is een voorbeeld van RNA polymerase.
RNA polymerase, is een enzym dat RNA synthetiseert door gebruik te maken van een
DNA template streng. Het verschil tussen RNA en DNA is dat RNA de suikergroep ribose
bevat i.p.v. deoxyribose en dat RNA uracil inbouwt i.p.v. thymine. Verder werkt RNA
polymerase net als DNA polymerase alleen in de 5’-3’ richting.
Lagging strand & primase, voor de leading strand is één primer genoeg, maar de lagging
strand heeft steeds nieuwe primers nodig. De beweging van de replicatievork zorgt
namelijk dat er steeds nieuwe ongepaarde basen tevoorschijn komen, waar dan weer
een nieuwe primer voor gemaakt moet worden omdat DNA polymerase maar in één
richting werkt. DNA polymerase blijft steeds nieuwe nucleotiden toevoegen aan een
Okazaki fragment totdat het de volgende primer tegenkomt.
Discontinue streng naar continue streng, de lagging streng bestaat uit allemaal korte
stukjes DNA die nog een RNA primer bevatten en om daar een continue DNA streng van
te maken, zijn 3 enzymen van belang:
- Nuclease, breekt de RNA primer af.
