Leerdoelen Biotechnologie & maatschappij D2
Les 4: Microbiële biotechnologie
Kunnen aangeven welke soorten micro-organismen er zijn en wat hun belang is voor de
biotechnologie.
Prokaryoten: bacterie en archaea
Eukaryoten: schimmels en protisten
Micro-organismen:
• Gebruikt voor duizenden jaren
• Enorme diversiteit
o 1% van de bacteriën geïdentificeerd
o 10% van de schimmels
• Enorme metabolische diversiteit
• Snelle groei (chemische fabriekjes)
• Genetisch toegankelijk
• Belangrijk modelsysteem (E.coli(pro) en S.cerevisae(eu))
De globale opbouw van bacteriën kunnen beschrijven.
Bouw van bacterie
• Celwand, plasmamembraan, geen celkern (wel nucleoid).
Cytoplasme en geen membraan omgeven organellen.
• Verschillende vormen
o Coccen: bolvormige
o Bacillen: staafvormige
o Spirocheten: spiraalvormige
Kunnen uitleggen wat het verschil is tussen een Gram-positieve en een Gram-negatieve
bacterie.
Gram-negatief: kleuren roze. Ze hebben een celwand met een dunne laag peptidoglycaan
en een tweede membraan die aan de ene kant bestaat uit
fosfolipiden en aan de andere kant Lipopolysaccharide(LPS). Dit
biedt als een extra beschermlaag (E.coli)
Gram-positief: kleuren Paars. Ze hebben een celwand met een
dikke laag peptidoglycaan.
Kunnen aangeven wat de functie is van fermentatie voor de cel, welke twee vormen van
fermentatie er zijn en van iedere vorm drie voorbeelden kunnen noemen van producten
die erdoor gemaakt worden.
Kweken van bacteriën
Sommige bacteriën zijn goed te kweken en in een laboratorium doen we dat vaak op
kleine schaal, bijvoorbeeld op voedingsbodems of vloeibare culturen (dan hebben
we culturen van een paar milliliter). Maar in industriële setting dan hebben we
enorme fermentoren nodig.
Die kunnen wel 10 duizend liter cultuur bevatten. In zo’n fermentor wordt alles
gecontroleerd. De pH, de hoeveelheid nutriënten, temperatuur, de hoeveelheid
zuurstof, en hierdoor kun je de condities heel constant houden en dit is nodig om de
groei optimaal te houden.
1
,Wat uiteindelijk het microbiële product is, dus het product dat je verkoopt, dat kan
verschillen. Soms zijn het hele cellen, soms gaat het om een bepaalde reactie en soms om
het onderdeel van een organisme.
• Cellen:
o Zakjes gist die je koopt, yakult
• Bioconversion (bepaalde omzetting die een bepaald MO kan doen)
o Maken van steroïde hormonen, zoals cortison en pretnison. En
het chemische proces van deze stoffen is complex met heel
veel stappen en je kunt dan bepaalde omzettingen laten doen
door bacteriën. Hierdoor wordt het aantal stappen sterk gereduceerd en de
productie veel goedkoper.
• Product van cel (iets dat door de cel gemaakt wordt)
o Citroenzuur, alchohol, aminozuren, allerlei secundaire metabolieten (zoals
antibiotica), of enzymen.
Voedselproductie (fermentatie)
• Oudste vorm van biotechnologie
• Sommige organismen kunnen zowel areaoob als anaeroob groeien, dan zijn de eerste
stappen hetzelfde, namelijk suiker wordt omgezet in pyruvate, maar daarna wordt
het anders;
o Als er zuurstof is wordt pyruvate verder afgebroken en wordt er ATP
gesynthetiseerd en daar wordt de elektronentransportketen voor gebruikt en
is zuurstof de elektronenacceptor. Hierbij wordt NADH weer omgezet in NAD+
o Als er geen zuurstof aanwezig is, dan moet er op een andere manier NADH
gerecycleerd worden. En er zijn twee manieren hoe dit vaak wordt gedaan;
▪ Melkzuur fermentatie (lactic acid)
▪ Alcohol fermentatie
o Van beide fermentatieprocessen maken wij als mensen gebruik van
Alcohol fermentatie
Hierbij wordt pyruvate omgezet in alcohol (ethanol) en CO2. En gist
is een organisme wat we hier veel voor gebruiken.
• En we gebruiken de vorming van alcohol voor het maken
alcoholische dranken
• En we gebruiken vorming van CO2 voor het rijzen van deeg.
Melkzuur fermentatie
Hierbij wordt pyruvate omgezet in melkzuur
• Gebruiken we om yoghurt te maken.
Vijf voorbeelden kunnen noemen van nuttige microbiële enzymen en hun toepassingen.
Toepassingen: enzymen
• Gebruikt voor voedselproductie en moleculairbiologisch onderzoek
o Restriction enzymes, ligase, Taq polymerase (biologisch onderzoek)
o Cellulases – stonewashed jeans (dagelijkse toepassingen)
o Proteases – was middelen, bier (voedselproductie)
o Lactases -lactose vrije melk (voedselproductie)
2
,Kunnen aangeven wat het belang is van thermofiele Archaea en hun enzymen en wat op
dit moment de hoogste temperatuur is waarbij leven mogelijk is.
Enzymen van extremofielen (Archaea)
Bij veel toepassingen van enzymen is het handig om gebruik te maken van enzymen die
stabiel zijn bij een hoge temperatuur, en daarom doet men veel onderzoek naar
extremofielen en dan vooral termofielen (organismen die leven bij een hoge temperatuur).
Veel extremofielen behoren tot de archaea en er wordt dan ook veel onderzoek gedaan naar
de enzymen van archaea. Hoe komen we eraan?
• Isoleren van organismen uit extreme omstandigheden (record is archaea 121 die bij
een temperatuur van 121 graden nog kan groeien)
• Veel extremofielen zijn niet op te kweken, wat je dan kan doen als alternatief is het
isoleren van DNA uit extreme omstandigheden. Dat je vervolgens al het DNA kloneert
en de nucleotide sequentie bepaalt. Dan ga je zoeken in de nucleotide sequenties
naar genen die coderen voor enzymen. Dit doe je door onbekende sequenties te
vergelijken met de sequenties van bekende enzymen.
Stap voor stap kunnen opnoemen hoe transformatie van bacteriën wordt uitgevoerd met
behulp van de CaCl2 methode (Fig. 3, hoofdstuk 5) en kunnen uitleggen wat competente
cellen zijn.
Sommige bacteriën zijn makkelijk genetisch te veranderen. Dit komt door de aanwezigheid
van plasmiden. Plasmiden kan je makkelijk uit de cel isoleren en er een nieuw gen in zetten
met knippen en plakken, en dan weer in een bacterie brengen door middel van
transformatie (twee methodes):
• CaCl2 behandeling
• Electroporatie
CaCl2 methode
• Je maakt de cellen competent (cellen die het vermogen hebben om genetisch
materiaal op te nemen). En dit doe je door een overnacht cultuur te nemen,
bijvoorbeeld van E.coli, door de cellen te scheiden van het medium en de cellen op te
nemen in een ijskoude CaCl2 oplossing. Deze competente cellen kun je als je er
glycerol aan toevoegt invriezen en bewaren tot je ze nodig hebt.
• De transformatie zelf:
o Je mengt de competente cellen met een plasmide en laat dit even staan op
ijs.
o Dan geef je het een korte hitte shock (42C) voor 1 minuut. En het idee is dat
dan het plasmide wordt opgenomen doordat er kleine openingen in het
membraan komen.
o Dan voeg je een medium toe (incubeer) en laat je de cellen nog 1 uur bij 37C
staan. (Zodat het antibioticum resistentie gen tot expressie komt)
o Dan plaat je de cellen uit op een voedingsbodem met een antibioticum, zodat
je selecteert op de cellen die het plasmide hebben opgenomen.
Kunnen uitleggen hoe electroporatie werkt en voordelen noemen t.o.v. transformatie
d.m.v. de CaCl2 methode.
CaCl2 werkt goed voor E.coli maar minder goed voor andere bacteriën of eukaryoten micro-
organismen. Een andere manier die dan veel gebruikt wordt is Elektroporatie
3
, Elektroporatie:
• Je mengt cellen met het plasmide dat je wil inbrengen. Dit doe je in een cuvet.
• Dan geef je een korte elektrische shock. De cellen zijn dan tijdelijk permeabel en
nemen het plasmide op.
• Dan voeg je een medium toe (incubeer) en laat je de cellen nog 1 uur bij 37C staan.
(Zodat het antibioticum resistentie gen tot expressie komt)
• Daarna groei je de cellen op een plaat met voedingsbodem met een antibioticum.
Voordelen Elektroporatie t.o.v. CaCl2 methode
• Sneller en Efficiënter (meer cellen hebben het plasmide opgenomen, dus hierdoor
hoef je minder cellen te gebruiken)
• Je kan het gebruiken voor meer soorten cellen (belangrijkste voordeel). Dus ook voor
archaea en eukaryoten cellen.
Kunnen uitleggen hoe je random mutaties maakt en hoe je gericht een gen uitschakelt in
bacteriën.
Soms is het ook belangrijk om een gen uit te schakelen. En het maken van mutaties gaat
relatief makkelijk in bacteriën.
• Ze zijn in grote aantallen. Als je een overnacht cultuur hebt, dan zitten daar al heel
veel cellen in en tussen die cellen zullen al heel veel mutanten zijn.
• Ook komt de mutatie meteen tot uiting en geven ze de mutatie meteen door aan de
volgende generatie. Omdat bacteriën haploïd zijn en ongeslachtelijk voortplanten.
• Mutaties gebeuren spontaan tijdens replicatie, maar je kunt ze ook induceren door
cellen te behandelen met UV-licht of een mutagene stof.
o Gedaan bij de schimmel die penicilline maakt. Ze hebben het met Uv-licht
bestraalt en mutanten geselecteerd die veel meer penicilline maken. Ze
hebben vervolgens deze mutanten weer gemutateniseerd en dit paar ronden
herhaald, waardoor ze een stam kregen die 1000x zoveel meer penicilline
maakten dan de oorspronkelijke wild type.
• Je kan ook door mutaties, ongewenste eigenschappen uitschakelen. Een nadeel van
dit soort mutaties is dat je random mutaties maakt op heel veel plekken in het DNA
en dat je dus niet precies weet waar. Het is daarom handig bij onderzoek om een gen
gericht uit te schakelen. Wat we dan doen is gebruik maken van homologe
recombinatie.
o Stel we willen Gen x uitschakelen. Dan kloneren we Gen x op een
plasmide. En de volgende stap is om het gen te inactiveren. Dit
doen we door het gen open te knippen en daar iets in te zetten,
bijvoorbeeld een gen dat codeert voor een antibioticum resistentie.
Nu is gen X niet meer intact. Dan knip je dit plasmide lineair en je
transformeert E.coli ermee.
o Het lineaire plasmide kan niet repliceren, dus dat zal verloren gaan.
Maar in een klein aantal cellen zal er homologe recombinatie
optreden omdat er twee bijna identieke DNA-moleculen zijn. En
hierdoor zal gen X op het chromosoom en het geïnactiveerde gen x
op het plasmide uitgewisseld. De cel zal vervolgens gaan delen en
4
