Les 4: Microbiële biotechnologie.
Kunnen aangeven welke soorten micro-organismen er zijn en wat hun belang is voor de
biotechnologie.
Micro-organismen zijn organismen die niet met het blote oog te zien zijn. Er zijn zowel prokaryote
(bacteriën en archaea) als eukaryote (schimmels en protisten) micro-organismen.
Micro-organismen worden gebruikt voor voedselproductie (bier, brood, kaas etc.). Er is een enorme
diversiteit in micro-organismen, waarvan er nog veel onbekend zijn. Deze diversiteit gaat gepaard
met een enorme metabolische diversiteit; ze komen op verschillende manieren aan nutriënten en
energie en bezitten allerlei enzymen. Ze maken ook enorm veel metabolieten die bruikbaar zijn voor
de mens.
Micro-organismen vermenigvuldigen zich snel, dit is handig om iets op grote schaal te produceren.
Daarnaast zijn veel micro-organismen genetisch toegankelijk; genen kunnen worden ingebracht,
veranderd of uitgeschakeld. Dit gaat maar voor een bepaald aantal soorten op, niet alle bacteriën zijn
op te kweken of genetisch te modificeren. E. coli (prokaryoot) en S. cerevisae (gist; eukaryoot) zijn
belangrijke modelsystemen in de biotechnologie.
De globale opbouw van bacteriën kunnen beschrijven.
Bacteriën zijn prokaryoot en hebben dus geen kern en organellen, maar wel een celwand. Bacteriën
komen voor in verschillende vormen, de meest voorkomende zijn de bolvormigen (coccen), de
staafvormigen (bacillen) en de spiraalvormigen (spirocheten).
,Kunnen uitleggen wat het verschil is tussen een Gram-positieve en een Gram-negatieve bacterie.
De indeling van grampositief en gramnegatief is gebaseerd op de gramkleuring, op basis van de bouw
van de celwand van bacteriën. Een gramkleuring geeft bacteriën met één dikke peptidoglycaanlaag
een paarse kleur (grampositief) en geeft bacteriën met een dunne laag peptidoglycaan tussen twee
membranen een roze kleur (gramnegatief). Het tweede membraan bij gramnegatieve bacteriën is
opgebouwd uit fosfolipiden en lipopolysachariden, en met eiwitten in het membraan.
Kunnen aangeven wat de functie is van fermentatie voor de cel, welke twee vormen van
fermentatie er zijn en van iedere vorm drie voorbeelden kunnen noemen van producten die erdoor
gemaakt worden.
Als er zuurstof aanwezig is in de cel kan de cel NADH recyclen via de elektronen transport keten,
maar als er geen zuurstof aanwezig is moet de cel een andere manier vinden om NADH te recyclen.
Een oplossing hiervoor is fermentatie, het afbreken van biologische materialen tot eenvoudigere
stoffen, in afwezigheid van zuurstof. Er is melkzuur fermentatie en alcohol fermentatie.
Bij alcohol fermentatie wordt pyruvaat omgezet in alcohol en CO2. De alcohol is nodig voor het
recyclen van NADH. Bij melkzuur fermentatie wordt pyruvaat omgezet in melkzuur.
,Vijf voorbeelden kunnen noemen van nuttige microbiële enzymen en hun toepassingen.
Restrictie enzymen, ligase, taq polymerase in moleculair biologisch onderzoek.
Cellulases -> stonewashed spijkerbroeken
Proteases zoals subtilisine -> wasmiddelen, bier
Lactases -> lactose vrij melk
Amylase -> afbraak van zetmeel voor het maken van mais siroop
Kunnen aangeven wat het belang is van thermofiele Archaea en hun enzymen en wat op dit
moment de hoogste temperatuur is waarbij leven mogelijk is.
Het is handig om enzymen te kunnen gebruiken die stabiel zijn bij een hoge temperatuur. Daarom
zijn thermofiele (levend bij extreem hoge temperatuur) archaea enorm belangrijk. Vaak is het
organisme zelf niet te kweken, maar dan wordt er DNA geïsoleerd, gekloneerd en gesequenced.
Op dit moment is de hoogste temperatuur waarbij ontdekt is dat er leven mogelijk is, 121 graden
Celsius.
Stap voor stap kunnen opnoemen hoe transformatie van bacteriën wordt uitgevoerd met behulp
van de CaCl2 methode (Fig. 3, hoofdstuk 5) en kunnen uitleggen wat competente cellen zijn.
De CaCl2 methode is een manier om bacteriën te transformeren, oftewel om ze een plasmide te laten
opnemen. Hiervoor worden de cellen eerst competent gemaakt; het vermogen om vreemd DNA op
te nemen vanuit de omgeving wordt verhoogd.
1. De cellen worden opgenomen in een ijskoude oplossing van CaCl 2 en blijven een tijdje op het
ijs staan tot ze competent zijn.
2. De competente cellen worden gemengd met de plasmiden.
3. Het mengsel blijft even op ijs staan.
4. Het mengsel wordt 1 minuut bij 42 graden Celsius gezet, een hitte shock, waardoor het
plasmide wordt opgenomen.
5. Er wordt 1 ml medium toegevoegd.
6. Het mengsel wordt 1 uur bij 37 graden Celsius gezet, zodat het antibioticum resistentie gen
tot expressie kan komen.
7. Een deel van de cellen wordt op platen met een antibioticum gebracht om cellen te
selecteren die het plasmide hebben opgenomen.
Het CaCl2 destabiliseert het membraan, tijdens de hitte shock ontstaan er kleine openingen in het
membraan waardoor het plasmide opgenomen kan worden. De CaCl2 methode werkt goed bij E. coli,
maar minder goed bij andere soorten bacteriën.
, Kunnen uitleggen hoe electroporatie werkt en voordelen noemen t.o.v. transformatie d.m.v. de
CaCl2 methode.
Electroporatie is ook een manier om bacteriën te transformeren. De cellen worden met de plasmiden
gemengd in een cuvet. Er wordt een korte elektrische shock gegeven, waardoor de cellen tijdelijk
permeabel zijn en het plasmide kunnen opnemen. Ook hier wordt er medium toegevoegd en worden
de cellen een uur geïncubeerd bij 37 graden Celsius, om het antibioticum resistentie gen tot
expressie te laten komen. Vervolgens worden de cellen op een plaat met antibioticum gegroeid.
Electroporatie is een snellere en efficiëntere manier om bacteriën te transformeren dan de CaCl2
methode. Meer cellen nemen het plasmide daadwerkelijk op waardoor er minder bacteriën en/of
plasmiden nodig zijn. Electroporatie kan daarnaast voor meer soorten cellen gebruikt worden.
Kunnen uitleggen hoe je random mutaties maakt en hoe je gericht een gen uitschakelt in bacteriën.
Het maken van random mutaties
Het maken van mutaties kan zorgen dat een gen in een bacterie wordt uitgeschakeld. Dit is een
relatief makkelijke manier, omdat bacteriën in grote aantallen voorkomen, waar al veel mutanten
aanwezig zullen zijn. Daarnaast komt een mutatie gelijk tot uiting omdat ze haploïd zijn, en een
mutatie wordt doorgegeven aan de volgende generatie omdat ze zich ongeslachtelijk voortplanten.
Mutaties gebeuren spontaan tijdens replicatie, maar ze kunnen ook geïnduceerd worden door cellen
te behandelen met UV-licht of een mutagene stof. Daarna kunnen de mutanten met de gewenste
eigenschap geselecteerd worden.
Gericht een gen uitschakelen
Om gericht een gen uit te schakelen wordt er gebruik gemaakt van homologe recombinatie. Als gen X
uitgeschakeld moet worden, wordt gen X gekloneerd op een plasmide. Het gen wordt geïnactiveerd
door het gen open te knippen, en daar een gen in te zetten (bijvoorbeeld een antibiotica resistentie
gen). Gen X is dan niet meer intact. Het plasmide wordt lineair geknipt en E. coli wordt ermee
getransformeerd.
Het lineaire plasmide kan niet repliceren en zal daarom verloren gaan. In een klein aantal cellen zal er
homologe recombinatie optreden, omdat er twee gelijke, op elkaar lijkende DNA moleculen zijn.
Hierdoor zal gen X op het chromosoom en het geïnactiveerde gen X op het plasmide uitgewisseld
worden. Als de cel gaat repliceren gaat het lineaire intacte gen X verloren en het geïnactiveerde gen
X wordt gerepliceerd in de cel. Dit gebeurt maar in een heel klein percentage cellen, maar hierop kan
geselecteerd worden, door het antibioticum resistentie gen te gebruiken.
Deze techniek kan ook gebruikt worden om nieuwe genen in te brengen in het chromosoom. Dit
hoeven geen bacteriële genen te zijn, het kunnen ook eukaryote of humane genen zijn.
