Mondzorgkunde jaar 1
Microbiologie periode 1: hoofdstuk 17, 20, 21 en 25 Parodontologie
Hoofdstuk 25 Microbiologische diagnostiek
Niet alleen de hoeveelheid plaque is bepalend voor het ontstaan voor parodontts, maar ook de
samenstelling ervan.
Tegenwoordig zijn er manieren om het DNA of RNA van de bacteriën te typeren en op basis hiervan
verder te diferentëren in vele subspecies. Bacteriën verschillen van elkaar in vele aspecten:
morfologie (vorm, groote, beweeglijkheid, kleuring), voedings-/groeikenmerken, gevoeligheid voor
antbiotca, kapseleigenschappen, DNA-kenmerken, antgene eigenschappen en genotypering.
Een bacterie bestaat uit cytoplasma omgeven door de celwand (celenveloppe). Het cytoplasma heef
een hoge osmotsshe druk, daarom moet de celwand stevig gebouwd zijn. Het genetsch materiaal
bestaat uit één DNA-streng. Er kunnen ook kleine DNA-fragmenten aanwezig zijn (plasmides) met
extra informate (bv. antbiotcaresistente, producte van toxinen). Plasmides kunnen worden
uitgewisseld tussen andere bacteriën.
De celwand van grampositeve bacteriën bestaat uit een
dikke peptdoglysaanlaag verweven met teishoïnezuur. Bij
gramnegateve bacteriën is de peptdoglycaanlaag veel
dunner, maar de wand wordt verder verstevigd door een
buitenmembraan die van de vorige laag gescheiden wordt
door een periplasmatsshe ruimte.
Het peptdoglycaan vormt een driedimensionaal netwerk en is het geraamte van de bacterie. De
lange draden in dit netwerk worden gevormd door aminosuikerketens met alternerend
N-asetylglusosamine en N-asetylmuraminezuur. Deze lange draden worden onderling
bijeengehouden door directe (sross-links) of indirecte (waterstofbruggen) verbindingen.
Gramnegateven hebben maar één laag, terwijl grampositeven wel uit 40 lagen bestaan met veel
onderlinge verbindingen.
De celwand van grampositeven bevat ook polymeren, masromolesulen en proteïnen. De zuren zijn
mede verantwoordelijk voor een negateve lading. De celwand van gramnegateven is veel
complexer: een peptdoglysaanwand, een peri-plasmatsshe ruimte en een buitenmembraan met
lipopolysashariden (LPS). De buitenmembraan speelt een rol bij het transport van elektronen.
Verder trefen we hier 3 soorten protennen aan: lipoprotennen, porievormende protennen en niet-
porievormende protennen.
Zowel gramnegateven als -positeven kunnen aan de buitenzijde van de celwand een kapsel of
slijmlaag beziten, dit is de glysosalix. Deze heef een signifcant efect op de bacteriële resistente
tegen fagocytose, bacteriële adhesie (binding), serologische eigenschappen en auto-aggregate.
Grampositeven: kapsel is opgebouwd uit homogene en soms heterogene polysachariden
Gramnegateven: kapsel is opgebouwd uit heterogene polysachariden
LPS zijn onderdelen van de celwand (combinates van koolhydraten en vetzuren). Ze steken uit aan
de buitenkant. Als deze in aanraking komen met het slijmvlies roept dit een ontstekingsreacte op
(antgene componenten). Dit is specifek voor gramnegateve organismen.
, Mondzorgkunde jaar 1
Microbiologie periode 1: hoofdstuk 17, 20, 21 en 25 Parodontologie
Differentiatie op basis aan aerschillende morfologische
eigenschappen
Gramkleuring
1. Kristalviolet aanbrengen
Grampositeven en -negateven kleuren beide roze
2. Ontkleuring
Grampositeven kleuren paars
Gramnegateven worden kleurloos ethanol spoelt de kleurstof weg
3. Basissh-fushsine aanbrengen (rode kleurstof)
Grampositeven blijven blauw-paars
Gramnegateven kleuren rood
De meeste paro-pathogenen zijn gramnegatef
Donkeraeldmicroscoop
Het object wordt belicht met lishtbundels die onder een stompe hoek invallen. Zodra de lichtbundels
op een bacterie schijnen, zullen de lichtstralen hierdoor verstoord worden. Op deze manier kun je
bacteriën waarnemen. De donkerveldmicroscoop toont ook flagellen.
Fasecontrastmicroscoop
Verdient de voorkeur bij de analyse van strusturen met geringe versshillen in brekingsindex. Deze
test kan snel uitgevoerd worden. Het zichtbaar maken van de bacteriën verhoogt de motvate van de
patënt om zijn mondhygiëne te verbeteren. Deze test is ook bruikbaar om een schimmelinfecte te
bewijzen.
Fluorescentiemicroscopie
Maakt deeltjes, voornamelijk antlishamen, zichtbaar die fuoresceren. Dit zijn deeltjes die licht
uitzenden wanneer ze worden blootgesteld aan ultraviolet lisht. Door een dergelijk specifek
fuorescerend antlichaam op een bacterie of op plaque aan te brengen, kunnen we bepaalde
antgene stofen opsporen (bv. een speciaal protenne). Zo zijn specifeke bacteriën te identfceren
wanneer deze een uniek protenne dragen.
Bacteriële aitaliteitskleuring
Niet alleen bacteriën worden zichtbaar, maar er wordt ook een onderscheid gemaakt tussen vitale
en dode spesies. Een eerste fuorescente stof kan binnendringen in bacteriën onafankelijk van hun
vitaliteit, een tweede stof kan alleen dode bacteriën binnendringen, omdat deze poriën vertonen in
hun celwand.
Differentiatie op basis aan fssiologische eigenschappen
Bacteriën hebben een aantal factoren nodig om te kunnen groeien:
- De juiste grondstofen voor energiewinning en opbouw van celmateriaal
- Een geschikte temperatuur algemeen
- De juiste luchtsamenstelling
- Water en een koolstof- en stkstooron
- Zwavel, fosfor en mineralen, zoals K, Mg, Ca specifek
- Sporenelementen, zoals Fe, Mn, Cu, Zn
Luchtsamenstelling
- Strikt aëroben: aanwezigheid O2
- Aëroben en facultatef anaëroben: bij hoge en lage O 2-spanning
, Mondzorgkunde jaar 1
Microbiologie periode 1: hoofdstuk 17, 20, 21 en 25 Parodontologie
- Micro-aërofelen: lage O2-spanning
- Strikt anaëroben: afwezigheid O2’
Voedingsfssiologie
Een algemene voedingsbodem bestaat uit leidingwater met toevoeging van 1% pepton (stkstooron)
en 0,5% NaCl (behoud isotonie). Hierin overleven bacteriën die niet veel eisen. Om bacteriën te
kunnen herkennen worden de nutriënten die worden bijgevoegd zodanig gekozen dat slechts één of
enkele species hierin kunnen groeien.
Als koloniekenmerken beoordelen we de vorm, de hoogte, de omtrek, het oppervlak, de optsche
eigenschappen en de kleur. Om de identfcate met 100% zekerheid te kunnen bevestgen, worden
de bacteriën na reincultuur microscopisch onderzocht en onderworpen aan een reeks van
biochemische tests, waarbij o.a. meerdere enzymatsshe astviteiten worden getest, inclusief de
fermentate van suikers.
Differentiatie op basis aan genetische eigenschappen
Met behulp van de PCR-teshniek (polymerase chain reacton) kunnen DNA-fragmenten die specifek
zijn voor een bacterie worden bijgemaakt, zodat deze later gemakkelijk kunnen worden opgespoord.
De PCR is een contnue herhaling van 3 stappen: DNA-scheiding, vasthaken van primer en
ketenverlenging. Naarmate de reacte vordert, ontstaan er alleen nog fragmenten van de gewenste
lengte (bepaald door de primers). Deze overmaat aan identeke fragmenten wordt van het overige
DNA gescheiden door elektroforese in een agarose-gel. Er wordt hierbij gebruik gemaakt van een
elektrisshe lading die DNA-moleculen bij een bepaalde pH beziten. Over de gel wordt een
elektrische spanning aangebracht, zodat de op één plaats aangebrachte moleculen naar de anode
migreren. Hierbij wordt de snelheid van de migrate bepaald door de grootte van de molesulen, de
sonsentrate agarose in de gel en de aangelegde spanning. Na een tjdje wordt het mengsel van
moleculen in de gel uit elkaar getrokken en op groote gesorteerd. Na deze scheiding worden de
dubbelstrengen met ethidiumbromide gekleurd, dat de bandjes zichtbaar maakt na belichtng met
Uv-licht.
Het nadeel van deze techniek is dat er enkel kwalitateve resultaten bekend worden (aan- of
afwezigheid van een bepaalde bacterie). Recentelijk kunnen er met een nieuwe techniek ook
kwanttateve resultaten worden bekendgemaakt. Hierbij wordt bijvoorbeeld een extra bprobe’
(vergelijkbaar met een primer, maar deze ligt tussen 2 primers) toegevoegd tjdens de PCR. Deze
probe wordt afgebroken tjdens de amplifcate van het DNA vanuit de primers en zendt hierbij
fuorescent licht uit.
Fragmentering aan DNA
Amplifed fragment length polymorphism (AFLP) wordt gebruikt om overdracht van paro-pathogene
bacteriën aan te tonen door te kijken naar verwantschappen tussen bacteriën. Na microbiële kweek
van 2 verschillende plaquestalen wordt het DNA van één bacteriële soort gensoleerd. Het DNA wordt
in stukjes geknipt met behulp van restriste-enzymen. Aan beide einden van de restrictefragmenten
worden adaptoren geligeerd. Vervolgens wordt er een selecteve amplifcate van deze
restrictefragmenten uitgevoerd, waarbij de adaptoren fungeren als bindingsplaatsen voor de PCR-
primers. De verschillende fragmenten worden van elkaar gescheiden in een polyacrylamidegel. 2
bacteriële stammen worden als verwant beschouwd als ze minder dan 3 bandjes van elkaar
verschillen.
DNA-probes ter detectie aan bacteriën
Een bacterie bestaat uit meerdere sequentes (unieke stukjes). Deze worden in het laboratorium
vermeerderd en geplakt aan de wand van een reageerbuisje. Hieraan voeg je het DNA uit de
, Mondzorgkunde jaar 1
Microbiologie periode 1: hoofdstuk 17, 20, 21 en 25 Parodontologie
pocketsample toe, dit bevat meerdere bacteriën. Het buisje wordt verwarmd, zodat het DNA
enkelstrengs wordt. Als de te onderzoeken bacterie in de pocketsample aanwezig is, zal deze gaan
binden aan de unieke sequente die aan de wand geplakt zat. Of dit gebeurt kun je zichtbaar maken
met een enzym dat op DNA bindt. Dit DNA met het enzym gaat dan binden aan dezelfde unieke
sequente. Hierna voeg je substraat toe met een kleur, waardoor de bacterie zichtbaar wordt.
Plaque-monsteropname en impact op bacteriële identifcatie
Voorbereiding
Bij een monstername uit de pocket gebruiken we watenrollen om contaminate met speeksel te
voorkomen en wordt de regio gedroogd met een luchtspuit. Supragingivale plaque dient ook
verwijderd te worden. De verdeling van de plaque binnen een pocket kan sterk variëren. Aangezien
het parodonttsproces zich apicaal afspeelt, wordt eerst het coronale deel van de pocket plaquevrij
gemaakt, zodat een monster van het diepste 2/3 deel kan worden genomen. Een papierpunt
absorbeert voor 90% de meest coronaal voorkomende bacteriën en is zeer snel verzadigd, daarom
worden er 2 tot 4 papierpunten gebruikt.
De ernst van de parodontts en de microbiële plaquesamenstelling varieert van pocket tot pocket.
Daarom worden er monsters genomen van 2 of meer pockets. Hiervoor worden de meest ontstoken
pockets gekozen.
Waarmee?
Parodontale curetes worden gebruikt om de plaque van een element te halen. Ook papierpunten
worden steeds vaker gebruikt. Ze absorberen de bzwemmende’ bacteriën in de pocket en laten de
aan de tandwortel gehechte micro-organismen met rust. Het voordeel van papierpunten is dat ze in
meerdere maten verkrijgbaar zijn. Deze papierpunten blijven zo’n 10 seconden in de pocket.
Vergelijking
De opening van de pocket is kleiner dan de doorsnede van een papierpunt of scaler. Het is dus
onmogelijk om het apicale deel van de pocket te kunnen bereiken. Scalers verwijderen 70% en
papierpunten 10% bacteriën uit de pocket. Het aantal bacteriën in het monster wordt bepaald door
de concentrate aan bacteriën in de pocket. De hoeveelheid bacteriën in een pocket neemt toe met
de diepte van de pocket. Ook wordt het aantal bacteriën bepaald door het type infecte. Patënten
met juveniele parodontts hebben minder bacteriën dan patënten met volwassen parodontts.
Hoofdstuk 17 Microbiologie aan parodontale
infecties
Antoni van Leeuwenhoek beschreef in 1683 met behulp van een eenvoudige microscoop bacteriën in
tandplaque. Ook legde hij het verband tussen het aantal bacteriën en geringe mondverzorging.
In 1890 deed W.D. Miller voor het eerst onderzoek naar de etologie van parodontts. Hij
concludeerde dat parodontts niet veroorzaakt wordt door één specifeke bacterie.
In het begin van de 20ste eeuw werd parodontts op basis van microscopisch onderzoek van de
subgingivale plaque toegeschreven aan amoeben, spirocheten en fusiforme bacteriën. Later werd
gedacht dat ook streptokokken en stafylokokken verantwoordelijk waren. Voor de behandeling van
parodontts werden patënten, op basis van de grote aantallen spirocheten, behandeld met neo-
salvarsan. Deze arsenicumverbinding kent ernstge bijwerkingen. Tot in het begin van de jaren 60
werd algemeen aangenomen dat parodontts het gevolg was van een anaerobe menginfecte waarbij
combinates van bacteriën pathogeen waren. De virulente (ziekmakend vermogen) van de
