Hoofdstuk 9, katalytische strategieën
Inleiding
Katalytische strategieën, in deze samenvatting zullen 4 katalytische strategieën behandeld worden:
1. Serine proteases, voorbeeld hiervan is chymotrypsine dat een reactie plaats laat vinden die
normaal immens sloom gaat.
2. Carbonic anhydrases
3. Restrictie endonucleases, een voorbeeld is EcoRV dat heel specifiek moet zijn.
4. Myosines, gebruiken vrije energie van ATP om processen plaats te laten vinden.
Elk van deze klassen heeft toevoeging van water aan het substraat nodig. Deze enzymen faciliteren
de vorming van de transitiestaat door het gebruik van bindingsenergie, induced fit en andere
specifieke katalytische strategieën.
Bindingsenergie, is de energie die vrij komt bij de vorming van een groot aantal zwakke interacties
tussen het enzym en substraat. Deze strategie wordt door enzymen gebruikt en heeft 2 functies:
1. Substraatspecificiteit, alleen het correcte substraat kan aan alle interacties deelnemen en
dus resulteren in maximale bindingsenergie.
2. Laat de katalytische efficiëntie toenemen
Het complete arrangement aan interacties wordt pas gevormd als het substraat zich in de
transitiestaat bevindt. Interacties tussen het enzym en substraat stabiliseren dus de transitiestaat,
waardoor de vrije energie van activatie verlaagd wordt.
Additionele strategieën, naast bindingsenergie en induced fit kunnen enzymen ook gebruik maken
van een van de volgende 4 strategieën om specifieke reacties te katalyseren:
1. Covalente katalyse, de active site bevat hierbij een reactieve groep. Dit is normaal gesproken
een krachtig nucleophile dat tijdelijk covalent verbonden raakt aan het substraat.
Chymotrypsine maakt hier bijvoorbeeld gebruik van.
2. Zuur-base katalyse, een molecuul anders dan water is hier de proton donor of acceptor. Zo
gebruikt chymotrypsine een basische katalyst om de nucleofiele kracht van serine te
vergroten, terwijl een histidine residu in carbonic anhydrase de verwijdering van een H
atoom van een zink gebonden water molecuul faciliteert om een hydroxide ion te genereren.
Bij myosines dient een fosfaatgroep van ATP als base om zijn eigen hydrolyse te promoten.
3. Katalyse door benadering (/by approximation), veel reacties hebben twee verschillende
substraten, zo ook alle 4 de klassen van hydrolyse die besproken zullen worden. In zulke
reacties kan de snelheid enorm toenemen door de substraten samen te brengen op een
enkel bindingsoppervlak. Zo brengt carbonic anhydrase CO2 en H2O samen.
4. Metaal ion katalyse, metaal ionen kunnen op meerdere manieren katalytisch functioneren.
Zo dient een zink ion in carbonic anhydrase voor de facilitatie van een nucleofiel zoals OH-.
Een metaal ion kan echter ook als elektrofiel dienen en de negatieve lading van een reactie
intermediate stabiliseren (magnesium in EcoRV). Tot slot kan een metaal ion ook als een brug
tussen enzym en substraat dienen,
waardoor de bindingsenergie toeneemt en
het substraat in een juiste conformatie
komt voor katalyse (maakt myosine
gebruik van).
Nucleofiel, nucleofiele atomen hebben de neiging
elektronen te doneren of met elektron-arme sites
te reageren, zoals protonen.
Elektrofiel, een nucleofiel doneert elektronen aan
een elektrofiel.
E-module
Vraag, zie rechts een vraag uit de e-module.
,9.1 Proteases faciliteren een fundamenteel lastige reactie
Peptidebinding hydrolyse, is cruciaal. Eiwitten die hun doel bereikt hebben, moeten afgebroken
worden tot aminozuren (AZ) en kunnen dan gerecycled worden. Ook moeten eiwitten uit het dieet
afgebroken worden tot kleine peptiden en AZ om opgenomen te kunnen worden. Tot slot zijn
proteolytische reacties nog van belang bij regulatie van bepaalde enzymactiviteit.
Hydrolysereactie, is het toevoegen van een watermolecuul aan een binding. In dit geval een
peptidebinding:
Resonantiestructuur, ondanks dat hydrolyse van een peptide binding
thermodynamisch favorable is, vinden zulke reacties heel sloom plaats. Dat komt
door de chemische natuur van een peptidebinding. De resonantiestructuur die
voor de planarity van een peptidebinding zorgt, zorgt er ook voor dat die resistent is tegen hydrolyse.
De C-N binding wordt dus versterkt door zijn dubbele-binding karakter. Verder is het carbonyl C
atoom hierdoor ook minder elektrofiel en vatbaar voor nucleophile attacks. Om een peptidebinding
klieving uit te voeren, moet een enzym dus een nucleofiel aanval faciliteren op een normaal
gesproken niet-reactieve carbonyl groep.
Chymotrypsine, klieft peptidebindingen selectief aan de carboxyl terminale zijde van grote
hydrofobe AZ zoals tryptofaan, tyrosine, phenylalanine en methionine. Dit enzym is een goed
voorbeeld van covalente katalyse. Het voert een krachtige nucleofiele aanval
uit op het niet-reactieve carbonyl C atoom van het substraat waarbij het
kortstondig covalent aan het substraat gebonden raakt.
Serine residu chymotrypsine, chymotrypsine bevat een uitermate reactief
serine residu en dat is ontdekt doordat behandeling met DIPF in een inactief
enzym resulteert. Hierbij wordt maar één serine residu (195) gemodificeerd
en deze chemische modificatie reactie stelt dus voor dat dit residu een
centrale rol speelt in het katalytisch mechanisme van chymotrypsine.
Chromogenic substrate, de enzym kinetica van chymotrypsine is verder onderzocht
m.b.v. een substraat analoog dat een gekleurd product vormt. Dit wordt vaker
gebruikt voor enzymkinetica onderzoek en in geval van chymotrypsine is een N-
acetyl-L-phenylalanine p-nitrophenyl ester gebruikt. Dit substraat is een ester i.p.v.
een amide, maar zal ook door het protease geknipt worden. Na klieving ontstaat
o.a. p-nitrophenolate wat een gele kleur geeft. Onderzoek hiermee leverede de
grafiek die rechts zichtbaar is. Hierin is te zien dat er een snelle uitbarsting van geel
ontstond, waarna een slomere formatie van de reactie de steady state bereikte. Dit
stelt voor dat hydrolyse in twee stappen optreedt.
2-stappen hydrolyse, in de eerste reactie cyclus die optreedt na het mixen, hoeft alleen de 1e fase
plaats te vinden om een gele kleur op te leveren. Maar in de reactiecycli daarna zijn beide fasen
nodig. De eerste fase vindt vele malen sneller plaats dan de tweede en dat verklaart de explosieve
toename aan geel meteen in het begin. De fases verlopen als volgt:
1. De acylgroep van het substraat raakt
covalent gebonden aan het enzym, waarbij in
dit geval p-nitrophenolate vrijkomt, maar in
het geval van een eiwit een amine. Zo
ontstaat er een complex dat acyl-enzym
intermediate genoemd wordt.
2. De acyl-enzym intermediate wordt gehydrolyseerd door dissociatie van het carboxylzuur
component van het substraat. Hierdoor wordt een vrij enzym gegenereerd.
Er wordt dus heel snel een p-nitrophenolate geproduceerd door elk enzym wanneer het acyl-enzym
intermediate gevormd wordt. Het duurt echter langer om het enzym weer te ‘resetten’ middels
hydrolyse van het acyl-enzym intermediate en beide fasen zijn nodig voor een enzym turnover.
, 3D structuur chymotrypsine, het enzym is grofweg sferisch en bestaat uit 3 polypeptideketens die
middels zwavelbruggen aan elkaar gelinkt zijn. Het wordt als een enkele polypeptide
gesynthetiseerd: chymotrypsinogeen. Deze inactieve vorm wordt geactiveerd middels proteolytische
klieving.
Active site chymotrypsine, ligt in een spleet aan het oppervlak van het enzym. Aan de hand van de
structuur kan de reactiviteit van het serine residu verklaard worden. De zijketen van serine 195 is
middels een H-brug aan de imidazole ring van histidine 57 verbonden. De NH groep van deze ring is
weer met een H-brug aan de carboxylaat groep van aspartaat 102 verbonden. Deze samenstelling
van residuen wordt de catalytic triad genoemd.
Katalytische triade, het histidine residu positioneert de serineketen en polariseert zijn hydroxyl
groep zodat het klaar is voor deprotonatie. In aanwezigheid van het substraat accepteert histidine de
proton van de OH groep van serine. Histidine dient hierbij dus als een general base catalyst. Het
ontnemen van het proton resulteert in een alkoxide ion wat een veel krachtiger nucleofiel is dan een
alcohol. Het aspartaat residu helpt bij de oriëntatie van histidine om het een beter proton acceptor
te maken middels de H-brug en elektrostatische effecten.
Peptidehydrolyse door
chymotrypsine, na substraat
binding (stap 1) begint het
zuurstofatoom van de zijketen van
serine 195 met zijn nucleofiele
aanval op het carbonyl C atoom van
het target peptide (stap 2).
Daardoor zijn er nu 4 atomen aan
het carbonyl C atoom gebonden die
in een tetrahedron gerangschikt
zijn i.p.v. de 3 atomen die in een
planar vlak eraan gebonden waren.
Dit instabiele tetrahedral
intermediate voert een negatieve
kracht uit op het zuurstofatoom
van de carbonylgroep. Deze lading
wordt gestabiliseerd door interactie
met NH groepen van het oxyanion
hole. Dit draagt bij aan stabilisatie van de transitiestaat die voorafgaat aan de vorming
van het tetrahedral intermediate. Het tetrahedral intermediate klapt ineen waarbij een
acyl-enzym ontstaat (stap 3). Deze stap wordt gefaciliteerd door de transfer van het
proton dat door het positief geladen histidine residu vastgehouden wordt en afgegeven
wordt aan de aminogroep van het te klieven eiwit. Het aminocomponent is nu vrij om
het enzym te verlaten (stap 4), waardoor de eerste fase van de hydrolytische reactie –
acetylatie van het enzym – afgerond is. De deacetylatie begint als een watermolecuul
de plek inneemt waar eerder het amino component zat (stap 5). De ester groep van het
acyl-enzym wordt nu gehydrolyseerd door een proces dat essentieel stap 2 tot 4 herhaalt. Histidine
werkt nu als een general acid catalyst en trekt een proton weg van water (om het later aan serine te
geven). Het resulterende OH- ion valt het carbonyl C atoom van de acyl groep aan en vormt een
