Dictaat Histologie
Eri k Me i je r
Hoorcollege 1
Histologie is de studie van weefsels van het lichaam en hoe deze weefsels tot organen vormen. Het
omvat alle aspecten van weefselbiologie met focus op hoe de celstructuur en ordening van cellen de
functies van organen optimaliseren.
Technieken
Een stuk weefsel moeten plakjes gemaakt van
worden en deze kunnen onder de microscoop
gelegd worden. Een lichtmicroscoop maakt
gebruik van een lichtbron. De vergroting van het
preparaat wordt bepaald door een combinatie
van de objectieflens en de oculairlens. De totale
vergroting van een sample is vergroting objectief
maal de vergroting oculair. Hoe groter de
vergroting hoe meer licht er nodig is en de sterkte
van het licht bij een lichtmicroscoop kan geregeld
worden door de condensor en het diafragma.
De hoeveelheid licht die de condensor doorlaat
bepaalt het contrast en de resolutie van een
afbeelding. De grootte van de vergroting bepaald
welke condensorgrootte gekozen wordt.
Wanneer de condensorgrootte te groot is komt er
te veel licht op het preparaat en dit zorgt voor
een schittering die het contrast slechter maakt.
Te weinig licht zorgt voor diffractie waardoor de resolutie slechter wordt. De condensor ligt onder
het preparaat en concentreert het licht van de lichtbron in een kegel die zorgt voor een gelijke
verdeling van lichtintensiteit over het hele preparaat.
Het diafragma bepaald de grootte van de lichtbundel die vanuit de lichtbron naar de condensor kan
gaan. Het bepaald dus hoe groot het gebied is dat kan worden gezien. Bij een te klein diafragma is er
een zwarte achthoekige omranding. Het diafragma moet zo worden ingesteld dat de hoeken net
buiten het gezichtsveld vallen, want bij een te groot diafragma kan er strooilicht zien die het beeld
verstoort. Wanneer het preparaat niet in het midden van het beeld valt dan moet de condensor
aangepast worden. Naast het diafragma en de condensor kan de lichtintensiteit worden aangepast
door de intensiteit van de lamp lager te zetten.
Het optimaal instellen van de microscoop gebeurt volgens het zogenaamde köhleren. Dit gaat in de
volgende stappen:
1. Draai het kleinste objectief boven het preparaat. Met deze vergroting kan de microscoop het
makkelijkst worden ingesteld.
2. Stel je beeld scherp met de grof‐ en fijnregelaars. Het beeld zal nog niet helemaal goed zijn
omdat het köhleren nog moet worden uitgevoerd.
3. Draai het velddiafragma dicht. Hiermee maak je het beeld erg klein.
1
, 4. Centreer het rondje van licht aan de hand van de stelschroeven aan het tafeldiafragma.
Hiermee zorg je ervoor dat het licht vanuit het midden gelijk verdeeld is.
5. Stel de randen van het rondje van licht scherp met de condensor. Hiermee wordt voor
gezorgd dat het licht over het gehele beeld even intens is.
6. Draai het velddiafragma open tot de zwarte randen net buiten beeld zijn. Zo zorg je ervoor
dat je in het gehele veld beeld hebt.
7. Draai het diafragma van de condensor tot het contrast beter wordt. Zo maak je het beeld
helemaal scherp.
Om een preparaat van weefstel te krijgen dat snijbaar is en bewaard kan worden, moeten de
volgende stappen doorlopen worden (zie afbeelding hieronder):
1. Fixatie: kleine stukjes weefsel worden in oplossingen gebracht met chemicaliën die cross-
links maken tussen eiwitten en die enzymen die de cel laten degraderen inactiveren.
Hierdoor blijft de cel- en weefselstructuur intact.
2. Dehydratie: het weefsel wordt door een serie van toenemende alcoholconcentraties
gehaald, eindigend in 100% waarna al het water verwijderd is.
3. Ophelderen: alle alcohol wordt verwijderd met behulp van organisch oplosmiddel (xyleen).
4. Infiltratie: het weefsel wordt geplaatst in gesmolten paraffine (kaarsvet) totdat het er
volledig door is geïnfiltreerd.
5. Inbedding: het met paraffine geïnfiltreerd weefsel wordt in een kleine mal met gesmolten
paraffine geplaatst waar het uit kan harden.
6. Trimmen: het blok paraffine wordt getrimd om het weefsel bloot te leggen om te snijden.
Er
zitten een aantal nadelen aan deze methode. Vetweefsel en membranen lossen goed op in ethanol
en dus geeft dit een afwijkend beeld van het weefsel. Deze afwijkingen in het preparaat ten opzichte
van het originele weefsel worden ook wel artefacten genoemd.
Fixatie gebeurd vaak met formaldehyde die gebufferd is en soms opgelost in een isotone oplossing
van 37%. Er zijn twee typen fixatie namelijk immersiefixatie en perfusiefixatie. Bij immersiefixatie
wordt het weefsel in het bakje met fixatief gelegd. Bij perfusiefixatie wordt bij proefdieren gedaan
door eerst een buffer door het hart te laten stromen zodat al het bloed verwijderd is en vervolgens
de fixatievloeistof door het hart te laten stromen. Bij immersiefixatie worden kleine stukjes weefsel
gefixeerd omdat de vloeistof van buitenaf binnen moet dringen en met veel weefsel kan dit fout
gaan. Perfusiefixatie geeft een mooier resultaat bij proefdieren, maar gaat wel makkelijker fout.
Het snijden van het weefsel gebeurd met behulp van een sledemicrotoom. Deze snijdt plakjes (of
coupes) die maar liefst 3 tot 10 µm dun zijn. Dit is dun genoeg om licht door te laten en is vaak maar
één cellaag te zien wat een mooi beeld geeft. Het snijden is erg lastig. Bij een bot mes ontstaan er
snijartefacten in de coupes. Als de paraffine droog is dan kan het brokkelen tijdens het snijden,
daarom wordt het bevochtigd. De hoek van het mes kan ervoor zorgen dat de coupes in elkaar
schuiven. Bij te snel snijden kunnen er gaten ontstaan. Bij het snijden gaat het perspectief ook van 3D
naar 2D, dus het is erg belangrijk om te weten vanuit welke oriëntatie het is gesneden. Het vlak
waarin je snijdt is erg belangrijk.
2
,Na het snijden van het weefsel is het soms handig om specifieke weefseltypen of eiwitten zichtbaar
te maken door middel van kleuring. Dit kan op twee manieren namelijk histochemie en
immunohistochemie. De histochemie is een chemische kleuring met een bepaalde eigenschap (vet,
zuur, basisch, etc.). Een bekende kleuring is de hematoxyline en eosine (HE) die een paars-roze kleur
geeft aan het weefsel. Periodic acid-Schiff reaction (PAS), Sudan Black (vetten) en metal
impregnation (bv. zenuwweefsel) zijn bekende kleuringen. De immunohistochemie wordt niet alleen
bij histologie gebruikt, maar ook in de biochemie. Deze kleuring gebeurd immunologisch. Voordat er
met de kleuring kan begonnen worden moeten de stappen tot een snijdbaar blok in omgekeerde
volgorde doorgelopen worden. De kleuring is een waterige oplossing en gaat niet samen met
paraffine.
Bij HE-kleuring zorgt de hemotoxyline, die een paars/blauwe kleur heeft, voor de kleuring van zure
celcomponenten. De stof is zelf basisch en hecht dus goed aan deze componenten. De
celcomponenten die onder andere worden gekleurd zijn DNA en de matrix in het kraakbeen. Eosine,
die een roze kleur heeft, zorgt voor de kleuring van basische celcomponenten, zoals het cytoplasma
en collageen. Kernen kunnen van cytoplasma gescheiden worden met deze kleuring.
Schiff’s reagent bij PAS reageert met hexose ringen van polysachariden. Deze gaan van kleurloos naar
intens rood. PAS kan goed gecombineerd worden met HE.
Sudan black is een vetoplosbare kleurstof die dus weefsels met veel vet kleurt, zoals vezelbanen en
vetweefsel. Dit type kleuring wordt gebruik voor diagnose van specifieke metabole aandoeningen,
waarbij vetten intracellulair ophopen.
Golgi is een zilverkleurige metaalkleuring waarmee het weefsel na impregnatie, met onder andere
zilvernitraat, wordt behandeld zodat het zilver wordt gereduceerd en zichtbaar is in de neuronen.
Kleurt neuronen aspecifiek, maar niet alle neuronen en is daarom geschikt om de morfol ogie van
neuronen te bekijken.
Bij immunohistochemie worden er met behulp van antilichamen specifieke eiwitten gekleurd. Dit
kan niet alleen een hulpmiddel zijn bij lichtmicroscopie, maar ook bij fluorescentie microscopie en
western blot (eiwitdetectie). Er zijn twee methoden namelijk direct en indirect. Bij de directe
methode bindt een gelabeld antilichaam direct aan het antigen. Bij de indirecte methode bindt eerst
een ander niet-gelabeld antilichaam aan het antigen en vervolgens binden secundaire gelabelde
antilichamen aan het eerste antilichaam. De indirecte methode maakt de respons sterker.
Een antilichaam bezit een aantal herkenningssites die kunnen binden aan een specifiek stukje op het
antigen. Dit specifieke stukje wordt ook wel het epitoop genoemd. Een antilichaam wordt gemaakt in
een dier tegen een specifiek epitoop. Het secundaire antilichaam heeft een label dat kan worden
gedetecteerd.
3
, Er zijn verschillende manieren waarop je kunt
labelen, namelijk chemiluminescentie en
fluorescentie. Chemiluminescentie werkt met
een enzym, namelijk Horse Radish Peroxidase
(HRP), die gebonden is aan een secundair
antilichaam. HRP zet luminol met behulp van
waterstofperoxide, om in licht en geoxideerd
luminol (zie afbeelding hiernaast).
Bij fluorescentie is er een speciale fluorescente
microscoop nodig. De eiwitten die gekoppeld zijn
aan het antilichaam lichten fluorescent op na
excitatie. Deze eiwitten worden fluoroforen
genoemd. De label heeft een specifieke golflengte nodig om geëxciteerd te worden. Verschillende
kleuren kunnen worden gebruikt om verschillende eiwitten op te laten lichten. Een nadeel van deze
methode is dat de omtrek van de cellen niet zichtbaar is, want iets dat niet gekleurd is, is niet
zichtbaar onder de microscoop. Cellen kunnen gevisualiseerd te worden door ze te kleuren met een
bepaalde kleurstof die oplicht onder de fluorescentiemicroscoop.
Er zit een verschil tussen histochemische kleuringen en immunologische kleuringen. Bij
histochemische kleuringen kijk je naar de structuur en opbouw van een weefsel. Bij immunologische
kleuringen wordt er gekeken naar de aanwezigheid van bepaalde eiwitten.
Eukaryoten
De reden dat cellen klein zijn is omdat veel materialen die de cel nodig heeft door diffusie in en uit
de cel gaan (vb. zuurstof in en koolstofdioxide uit). Wanneer een cel heel groot zou zijn zou het erg
lang duren voordat alle stoffen gediffundeerd zijn. Een kleine cel heeft veel oppervlakte ten opzichte
van volume en kan dus snel stoffen uitwisselen met de omgeving. Cellen zijn niet oneindig klein
omdat alle genetische informatie en de celorganellen in de cel moeten passen. De cel is precies groot
genoeg om dit alles te passen, maar niet te groot dat diffusie traag verloopt.
Cellen zijn erg complex en waren onzichtbaar tot de uitvinding van de microscoop. De
lichtmicroscoop kan cellen vergroten met behulp van licht en lenzen van ongeveer 40x tot 400x. Een
ander type microscoop is de elektronenmicroscoop. Bij een elektronenmicroscoop worden
elektronen op het weefsel afgeschoten met een hoge snelheid. Op deze snelheid gedragen
elektronen zich als een golf. Er zijn gedeeltes van het weefsel waar de elektronen makkelijk door
kunnen passeren, electron lucent, en deze gebieden zijn lichtgekleurd. Er zijn ook gedeeltes waar
elektronen moeilijk kunnen passeren of zelfs gereflecteerd worden, electron dense, en deze
gebieden zijn donkergrijs/zwart gekleurd. Omdat elektronen een veel kleinere golflengte hebben dan
licht is de resolutie van een elektronenmicroscoop vele malen kleiner dan die van de lichtmicroscoop
(tot wel 3 nm resolutie). Deze extreem goede resolutie levert vergrotingen op van 120.000 tot wel
400.000 keer. Een nadeel van de elektronenmicroscoop is dat het object dat bekeken wordt dood is.
4
, Er kan onderscheid gemaakt worden tussen twee celtypen namelijk de prokaryotische cel en de
eukaryotische cel. Het grootste verschil tussen de twee celtypen is dat een prokaryotische cel geen
celkern heeft en een eukaryotische cel wel. Daarnaast zijn eukaryotische cellen vaak een stuk groter
en complexer. Eukaryote cellen bevatten een aantal celorganellen (zie afbeelding hieronder).
De celwand of het celmembraan is een fysieke barrière die voorkomt dat stoffen zomaar in en uit de
cel kunnen gaan. Het membraan bestaat uit een zogenaamde fosfolipide dubbellaag. Dit zijn twee
lagen van vetmoleculen die een polaire kop en een apolaire staart hebben. Deze laag is flexibel en
het cytoskelet zit verankerd in het membraan. In de celwand zitten allerlei transmembraaneiwitten.
Deze eiwitten maken selectieve permeabiliteit mogelijk. Dit houdt in dat het passeren van ionen,
nutriënten en moleculen door het membraan heen kunnen door deze eiwitten, maar dit gebeurt op
een gecontroleerde manier. Doordat er een verschil is in positieve en negatieve ion concentraties, is
er sprake van een zogenaamd elektrochemische gradiënt. Deze gradiënt zorgt ervoor dat er een
elektrisch potentiaal over het membraan meetbaar is, ook wel de membraanpotentiaal genoemd.
Dit potentiaal is erg belangrijk voor allerlei processen die zich afspelen aan het membraan. Om de
potentiaal in stand te houden zijn er transmembrane ionkanalen. Deze kanalen zijn in staat om met
behulp van ATP-ionen tegen de gradiënt in te pompen. Hierdoor blijft er een potentiaalverschil. Er
zijn een aantal soorten ion-kanalen. Allereerst zijn er de voltage gated ionkanalen. Deze ionkanalen
worden geactiveerd als er een verandering in het spanningsveld plaatsvindt. Ligand gated ionkanalen
worden geactiveerd als er een bepaald eiwit (ligand) bindt. Als derde zijn er ook nog zogenaamde
leaky kanalen. Deze kanalen staan standaard open en vervoeren een bepaald ion passief. Het
celmembraan zorgt ook voor communicatie. Op het membraan zitten transmembrane receptoren
die wanneer gebonden door een bepaalde stof, bepaalde reacties in de cel bewerkstelligen.
Daarnaast zitten er op het membraaneiwitten die verantwoordelijk zijn voor intracellulaire
communicatie, dus communicatie tussen cellen. Op de afbeelding hieronder is een afbeelding van
een stuk membraan te zien.
5
